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1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一類原因不明的慢性、進(jìn)行性自身免疫疾病,以關(guān)節(jié)慢性炎癥為主要表現(xiàn),炎癥關(guān)節(jié)局部常常有嚴(yán)重的關(guān)節(jié)破壞和骨丟失。關(guān)節(jié)骨質(zhì)侵蝕成為近年米R(shí)A研究的特點(diǎn)之一,對(duì)RA的治療側(cè)重于快速有效控制病情,阻止長(zhǎng)期病情對(duì)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)和功能的損壞,抑制破骨細(xì)胞性骨破壞和炎癥性骨丟失。RA病灶部位有大量的成熟破骨細(xì)胞提示破骨細(xì)胞是導(dǎo)致關(guān)節(jié)侵蝕的主要細(xì)胞,其數(shù)量和功能決定了RA關(guān)節(jié)破壞與骨丟失的嚴(yán)重程
2、度。甲氨喋呤(Methotrexate,MTX)是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的首選藥物,可調(diào)節(jié)患者的異常免疫功能,在關(guān)節(jié)炎的病理改變上,MTX可減少骨質(zhì)侵蝕,阻止或延緩關(guān)節(jié)破壞,減少殘疾,對(duì)早期控制病程進(jìn)展比較有益。但小劑量MTX治療RA的機(jī)制仍然不是很清楚。本實(shí)驗(yàn)分析研究了MTX對(duì)小鼠破骨細(xì)胞的影響,試圖揭示MTX控制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨破壞以破骨細(xì)胞為靶細(xì)胞的可能作用機(jī)制,為MTX的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。 本文采用MC3T3-E1小鼠成
3、骨細(xì)胞株與C57BL/6小鼠原代骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)體系。MC3T3-E1小鼠成骨細(xì)胞株傳代培養(yǎng)后,消化重懸。6~8周齡雄性C57BL/6小鼠處死后,無菌取股骨和脛骨,收集骨髓單核細(xì)胞,加入培養(yǎng)液重懸。在培養(yǎng)皿中分別加入密度為1×106cells·mL-1的MC3T3-E1及密度為2×107 cells·mL-1的骨髓前體細(xì)胞共培養(yǎng)。兩天后半量換液,并加入終濃度280 ng·mL-1的IL-1β和終濃度10 ng·mL-1的M-CSF誘導(dǎo)破骨
4、細(xì)胞生成,繼續(xù)培養(yǎng)2大收集破骨細(xì)胞,置于新的培養(yǎng)皿中進(jìn)行純化培養(yǎng)。分別設(shè)置空白對(duì)照組,IL-1β對(duì)照組,IL-1β聯(lián)合濃度為0.01~10umol·L-1的MTX用藥組,觀察藥物對(duì)純化破骨細(xì)胞的作用。研究采用MTT法測(cè)定甲氨喋呤對(duì)破骨細(xì)胞增殖作用的影響;流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定甲氨喋呤對(duì)破骨細(xì)胞調(diào)亡的影響;RRAP染色和骨吸收陷窩染色記數(shù)、骨吸收陷窩面積測(cè)定分別觀察甲氨喋呤對(duì)破骨細(xì)胞活性及功能的影響;收集48h細(xì)胞培養(yǎng)上清,ELISA法測(cè)定甲氨喋
5、呤對(duì)破骨細(xì)胞MMP-9分泌的影響;提取破骨細(xì)胞RNA,RT-PCR法測(cè)定甲氨喋呤對(duì)破骨細(xì)胞中MMP-9、RANK基因表達(dá)的影響。 結(jié)果:光鏡下,觀察共培養(yǎng)體系的細(xì)胞形態(tài),可見純化的破骨細(xì)胞表現(xiàn)出體積大、多核、偽足以及TRAP染色陽性等破骨細(xì)胞特征。骨片上,形成典型的骨吸收陷窩以及破骨細(xì)胞肌動(dòng)蛋白環(huán),證明本次實(shí)驗(yàn)建立的共培養(yǎng)體系可以成功誘導(dǎo)出具有骨吸收功能的破骨細(xì)胞。 MTT法測(cè)定破骨細(xì)胞增殖的結(jié)果表明,MTX對(duì)破骨細(xì)胞增殖的抑制
6、作用,呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性,隨著濃度的升高,其抑制作用增強(qiáng)。0.01gmol·L-1的MTX對(duì)破骨細(xì)胞活性沒有抑制作用。0.1~101xmol·L-1MTX都具有抑制破骨細(xì)胞增殖的作用,其中0.1μmol·L-1和1μmol·L-1的MTX處理組的破骨細(xì)胞增殖水平顯著低于空白對(duì)照組,10μmol·L-1MTX處理組的破骨細(xì)胞增殖水平最低,與空白對(duì)照組相比差異極顯著。 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定破骨細(xì)胞凋亡結(jié)果表明,IL-1β顯著抑制破骨細(xì)
7、胞凋亡。MTX處理組則表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡作用,0.01μmol·L-1和0.1μmol·L-1的MTX處理組,破骨細(xì)胞凋亡比例略低于空白對(duì)照組,但是仍然高于IL-1β處理組,表現(xiàn)出誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡作用。1μmol·L-1和10μmol·L-1的MTX可以完全拮抗IL-1β的抑制凋亡作用,破骨細(xì)胞凋亡比例顯著增加,甚至高于空白對(duì)照組,證明隨著濃度升高,MTX誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)。Hoechst染色法進(jìn)行破骨細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀
8、察,其結(jié)果也顯示出同樣的趨勢(shì)。 ELISA法測(cè)定破骨細(xì)胞MMP-9分泌結(jié)果表明,MTX只在較高濃度水平對(duì)IL-1β刺激的MMP-9分泌有抑制作用,在低濃度水平則沒有作用甚至出現(xiàn)相反的作用趨勢(shì)。 破骨細(xì)胞骨吸收功能測(cè)定結(jié)果表明,IL-1β處理組破骨細(xì)胞計(jì)數(shù),骨吸收陷窩計(jì)數(shù),骨吸收陷窩平均面積以及骨吸收陷窩總面積,四個(gè)指標(biāo)均高于空白對(duì)照組,表明IL-1β可以顯著提高破骨細(xì)胞骨吸收功能。MTX處理組,在這四個(gè)指標(biāo)上均可拮抗IL
9、-1β作用,顯示出抑制破骨細(xì)胞骨吸收功能結(jié)果,其抑制作用呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。 對(duì)RT-PCR電泳圖像的分析結(jié)果表明,IL-1β可顯著刺激破骨細(xì)胞中RANK、MMP-9的mRNA的表達(dá)。MTX在0.01μmol·L-1至10μmol·L-1時(shí)均可抑制IL-1β對(duì)破骨細(xì)胞RANK的mRNA表達(dá)的刺激作用,在1μmol·L-1至10μmol·L-1其抑制作用與IL-1β對(duì)照組相比差異顯著。MTX只在1μmol·L-1至10μmol
10、·L-1時(shí)對(duì)IL-1β刺激的破骨細(xì)胞MMP-9的mRNA表達(dá)具有抑制作用。 綜上所述,本研究結(jié)果顯示,IL-1β顯著抑制破骨細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)其骨吸收功能。同時(shí)可顯著刺激破骨細(xì)胞中RANK、MMP-9的mRNA的表達(dá),在破骨細(xì)胞培養(yǎng)48h時(shí),可顯著刺激破骨細(xì)胞金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-9的分泌,在破骨細(xì)胞分化激活中具有重要作用。MTX可拮抗IL-1β對(duì)破骨細(xì)胞的作用,對(duì)IL-1β誘導(dǎo)生成的破骨細(xì)胞,具有抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,顯著促
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