ClC-3通過NF-κB信號通路調(diào)控P-gp介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥的研究.pdf

1、目的：
　　研究ClC-3(voltage-gated chloride channel3)氯通道蛋白調(diào)控P-糖蛋白（P-glycoprotein。P-gp）介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥的分子機(jī)制，確定ClC-3是通過NF-кB信號通路來調(diào)控P-gp的表達(dá)，為進(jìn)一步研究ClC-3在腫瘤中的作用以及基于逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的腫瘤治療提供靶點(diǎn)及理論依據(jù)。
　　方法：
　?、賅estern blot檢測人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7及其阿霉素耐藥株M

2、CF-7/ADR中NF-кB P65、IкBα、IKKα、IKKβ的表達(dá)。② MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染ClC-3表達(dá)質(zhì)粒
　?。╬cDNA3.1/ClC-3）增強(qiáng)ClC-3的表達(dá)，Western blot檢測過表達(dá)ClC-3后的細(xì)胞NF-кB P65、IкBα、pIкBα/ser32、IKKα、IKKβ的表達(dá)。③細(xì)胞免疫熒光檢測MCF-7細(xì)胞的ClC-3表達(dá)增加后對NF-кB P65核轉(zhuǎn)移的影響。④雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)
　?。╬

3、-NF-κB-luc和pRL-TK-Vector）檢測 MCF-7細(xì)胞的ClC-3表達(dá)增加后對NF-κB轉(zhuǎn)錄活性水平的影響。⑤MCF-7細(xì)胞用脂多糖LPS刺激或轉(zhuǎn)染P65 SiRNA后，雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測NF-κB轉(zhuǎn)錄活性水平，熒光定量PCR和Western blot檢測NF-κB轉(zhuǎn)錄活性改變對MDR1 mRNA和P-gp表達(dá)的影響。⑥ MCF-7細(xì)胞 ClC-3表達(dá)增加后，再轉(zhuǎn)染P65 SiRNA抑制NF-κB信號通路，熒光定

4、量PCR和Western blot檢測對MDR1 mRNA和P-gp表達(dá)的影響。⑦M(jìn)CF-7細(xì)胞上調(diào)ClC-3表達(dá)后再抑制NF-κB信號通路（轉(zhuǎn)染P65 Si RNA），MTT法檢測抗癌藥物紫杉醇對干預(yù)后細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：
　?、?MCF-7/ADR細(xì)胞的IKKα、IKKβ、NF-кB P65蛋白表達(dá)量明顯高于MCF-7細(xì)胞。IкBα表達(dá)量則降低。②上調(diào)MCF-7細(xì)胞ClC-3的表達(dá)量，其IKKα、IKKβ、NF-

5、кBP65、pIкBα/ser32蛋白表達(dá)量明顯增加。③上調(diào)MCF-7細(xì)胞ClC-3的表達(dá)量后，NF-кB P65蛋白從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。④ ClC-3能作用于NF-кB P65靶位點(diǎn)，轉(zhuǎn)染后增加NF-кB P65相對螢光素酶值，提高轉(zhuǎn)錄活性水平。⑤ LPS激活MCF-7細(xì)胞NF-κB信號通路，上調(diào)MDR1 mRNA和P-gp的表達(dá)；P65 Si RNA抑制NF-κB信號通路，下調(diào)MDR1 mRNA和P-gp的表達(dá)。⑥增加MC