柚皮素對(duì)K562-A02細(xì)胞P-gp的影響及其與NF-κB的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、背景:
　　柚皮素是一種來源豐富,具有良好生物活性的二氫黃酮類化合物。研究表明,柚皮素能明顯地抑制P-gp的活性,從而影響自身或其他藥物的代謝動(dòng)力學(xué)行為甚至改變藥物效應(yīng);柚皮素亦能阻抑 NF-κB的表達(dá)及活性,從而影響靶基因及蛋白的表達(dá),發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用。但圍繞柚皮素對(duì)MDR1 mRNA及P-gp表達(dá)影響的研究卻鮮有報(bào)道,就柚皮素、MDR1 mRNA及P-gp、NF-κB三者間的關(guān)聯(lián)亦有待闡明?；贜F-κB是眾

2、多細(xì)胞信號(hào)通路中調(diào)控MDR1轉(zhuǎn)錄及P-gp表達(dá)的重要核轉(zhuǎn)錄因子之一,研究柚皮素對(duì)MDR1 mRNA、P-gp表達(dá)的影響及其與NF-κB間的關(guān)聯(lián),可為柚皮素對(duì)P-gp影響的分子生物學(xué)機(jī)制研究提供新思路。
　　目的:
　　建立及評(píng)價(jià)穩(wěn)定高表達(dá)MDR1 mRNA及P-gp的K562/A02細(xì)胞模型,在此基礎(chǔ)上,采用RT-PCR、Western-blot等技術(shù)手段研究柚皮素對(duì)MDR1基因轉(zhuǎn)錄、P-gp表達(dá)的影響及其與NF-κB間的關(guān)

3、聯(lián),初步探討柚皮素對(duì)P-gp影響的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　方法:
　　1.規(guī)范化培養(yǎng)K562/A02細(xì)胞,以1μg/ml阿霉素維持細(xì)胞耐藥性,實(shí)驗(yàn)前2周脫藥培養(yǎng),觀察細(xì)胞生長狀況,繪制細(xì)胞生長曲線。
　　2.采用MTT法檢測(cè)PDTC、阿霉素、柚皮素對(duì)K562/A02的細(xì)胞毒性作用,選取細(xì)胞存活率大于80％的條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3.將不同濃度NF-κB特異性抑制劑PDTC和NF-κB促進(jìn)劑阿霉素單獨(dú)或聯(lián)合作用于K

4、562/A02細(xì)胞模型48h后,采用RT-PCR、Western-blot等技術(shù)手段檢測(cè)MDR1 mRNA及P-gp表達(dá)水平的變化,評(píng)價(jià)K562/A02細(xì)胞模型MDR1 mRNA及P-gp的表達(dá)情況。
　　4.將不同濃度柚皮素單獨(dú)或聯(lián)合5μM阿霉素作用于K562/A02細(xì)胞模型48h后,采用RT-PCR、Western-blot等技術(shù)手段檢測(cè)MDR1 mRNA及P-gp表達(dá)水平的變化,評(píng)價(jià)柚皮素對(duì)K562/A02細(xì)胞MDR1 mR

5、NA及P-gp表達(dá)的影響。
　　5.將500μM柚皮素、25μM PDTC單獨(dú)或聯(lián)合5μM阿霉素作用于K562/A02細(xì)胞模型48h后,采用RT-PCR、Western-blot等技術(shù)手段檢測(cè)MDR1 mRNA及P-gp表達(dá)水平的變化,比較各組間的差異,探討柚皮素、MDR1 mRNA及P-gp、NF-κB三者間的關(guān)聯(lián)。
　　結(jié)果:
　　1.與空白組相比,5~100μM PDTC作用于K562/A02細(xì)胞48h后能明顯下

6、調(diào)其MDR1 mRNA及P-gp的表達(dá)(P<0.05),且抑制作用隨濃度的增加而增強(qiáng)。
　　2.與空白組相比,0.5~15μM阿霉素作用于K562/A02細(xì)胞48h后,0.5~15μM阿霉素能明顯上調(diào)其MDR1 mRNA的表達(dá)(P<0.05),1~15μM阿霉素能明顯上調(diào)其P-gp的表達(dá)(P<0.05),且促進(jìn)作用隨濃度的增加而增強(qiáng)。
　　3.與陽性對(duì)照組(5μM阿霉素)相比,5~100μM PDTC與5μM阿霉素聯(lián)合作用于

7、K562/A02細(xì)胞48h后,25μM、50μM PDTC明顯下調(diào)其MDR1 mRNA的表達(dá)(P<0.05),5μM、25μM、50μM PDTC明顯下調(diào)其P-gp的表達(dá)(P<0.05),且抑制作用均隨PDTC濃度的增加而增強(qiáng)。
　　4.與空白組相比,25~500μM柚皮素作用于K562/A02細(xì)胞48h后,100~500μM柚皮素明顯下調(diào)其MDR1 mRNA的表達(dá)(P<0.05),50~500μM柚皮素明顯下調(diào)其P-gp的表達(dá)(

8、P<0.05),且抑制作用隨柚皮素濃度的增加而增強(qiáng)。
　　5.與陽性對(duì)照組(5μM阿霉素)相比,25~500μM柚皮素與5μM阿霉素聯(lián)合作用于K562/A02細(xì)胞48h后,250μM、500μM柚皮素明顯下調(diào)其MDR1 mRNA的表達(dá)(P<0.05),50~500μM柚皮素明顯下調(diào)其P-gp的表達(dá)(P<0.05),且抑制作用均隨濃度的增加而增強(qiáng)。
　　6.與25μM PDTC組相比,500μM柚皮素作用于K562/A02細(xì)胞

9、48h后,能同等程度抑制其MDR1 mRNA及P-gp的表達(dá)(P>0.05);與25μM PDTC與5μM阿霉素聯(lián)合作用組相比,500μM柚皮素與5μM阿霉素聯(lián)合作用于K562/A02細(xì)胞48h后,能同等程度抑制阿霉素誘導(dǎo)MDR1 mRNA及P-gp的表達(dá)(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.本研究建立的K562/A02細(xì)胞模型能穩(wěn)定特異性高表達(dá)MDR1 mRNA及P-gp,是研究藥物、MDR1 mRNA及P-gp、NF-