DATS對(duì)乳腺癌干細(xì)胞P-gp及NF-κB的表達(dá)調(diào)控及逆轉(zhuǎn)ADM耐藥性研究.pdf

1、目的：
　　乳腺癌已經(jīng)成為目前女性最高發(fā)的惡性腫瘤之一，并顯示出了年輕化[1]。經(jīng)手術(shù)放化療后，腫瘤仍出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，多是由于腫瘤干細(xì)胞顯示出的多藥耐藥性引起。耐藥的腫瘤細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)異常可能提示耐藥性與NF-κB（nuclear factorκB，細(xì)胞核因子κB）之間可能存在某些聯(lián)系[2]。NF-κB的下游基因中很可能有P-gp，當(dāng)NF-κB被激活，P-gp蛋白表達(dá)增高從而引起癌細(xì)胞的耐藥[3]。DATS(diallyl tr

2、isulfide，二烯丙基三硫化物，又稱(chēng)大蒜素），作用靶點(diǎn)多且高效低毒，在逆轉(zhuǎn)耐藥方面有良好前景[4]。本課題研究的為DATS逆轉(zhuǎn)乳腺癌腫瘤干細(xì)胞耐藥的作用，以及是否因抑制NF-κB的異常激活，從而對(duì)P-gp的表達(dá)產(chǎn)生抑制，由此逆轉(zhuǎn)乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的耐藥。
　　方法：
　　采用貼壁培養(yǎng)及球囊培養(yǎng)，加之流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞株及MCF-7/ADM阿霉素耐藥的細(xì)胞株中乳腺癌干細(xì)胞含量的比例；再使用球囊培養(yǎng)的方法富集MCF-

3、7/ADM耐藥株中乳腺癌干細(xì)胞；采用Annexin V聯(lián)合7-AAD雙染法檢測(cè)DATS對(duì)MCF-7/ADM球囊細(xì)胞（乳腺癌干細(xì)胞）及貼壁細(xì)胞（乳腺癌細(xì)胞）毒性，以及使用DATS逆轉(zhuǎn)耐藥前后的ADM（阿霉素）對(duì)細(xì)胞毒性作用；Western Blotti ng檢測(cè)DATS對(duì)P-gp以及EMSA方法檢測(cè)NF-κB表達(dá)的調(diào)節(jié)，所有的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件完成分析。
　　結(jié)果：
　?。?）MCF-7細(xì)胞以及MCF-7/A

4、DM細(xì)胞的球囊生成率分別為1.13±0.55％和10.16±0.54％，流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種細(xì)胞株中CD44+CD24-細(xì)胞的比例分別為2.83±1.38％和63.94±2.31％。耐藥株中的癌干細(xì)胞比例更高，兩者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（以上P<0.05，n=3）
　?。?）DATS濃度為10、20μ mol/L時(shí)MCF-7/ADM貼壁細(xì)胞與球囊細(xì)胞凋亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），當(dāng)DATS濃度為40、60、80μmol/L時(shí)，MC

5、F-7/ADM球囊細(xì)胞凋亡率低于貼壁細(xì)胞，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，n=3）。當(dāng)DATS濃度為60μmol/L作用24h后，細(xì)胞凋亡率明顯增高。
　?。?）在DATS濃度為10μmol/L作用下使用化療藥物5μmol/L ADM作用24h后，MCF-7/ADM的貼壁細(xì)胞與球囊細(xì)胞的凋亡率（41.07±0.29%、10.30±0.79%）明顯高于單獨(dú)使用化療藥物ADM細(xì)胞組（25.46±0.58%、5.42±0.31%），

6、且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，n=3)。經(jīng)過(guò)撤藥24h后，單純化療藥物細(xì)胞組凋亡率下降，而聯(lián)合DATS細(xì)胞組凋亡率有上升趨勢(shì)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且球囊細(xì)胞加入DATS后化療的敏感性相對(duì)上升。
　?。?）MCF-7/ADM的球囊細(xì)胞較貼壁細(xì)胞有明顯的P-gp及NF-κB表達(dá)；DATS作用于兩種細(xì)胞后P-gp與NF-κB均被抑制，差異有意義（P<0.05，n=3）；在DATS作用下，使用化療藥物ADM24h后，兩組細(xì)胞的P-g

7、p及NF-κB表達(dá)明顯抑制更加顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，n=3）。
　?。?）Western Blotting檢測(cè)不同濃度的PDTC（NF-κB抑制劑）處理兩種細(xì)胞24h后，10μmol/L DATS與不同濃度PDTC作用，兩組細(xì)胞株P(guān)-gp表達(dá)抑制且呈濃度依賴(lài)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。40μmol/L PDTC聯(lián)合DATS比0μmol/L PDTC聯(lián)合DATS處理24h后對(duì)P-gp的表達(dá)有明顯的抑制作用(P<0.05)；4

8、0μmol/L的PDTC與DATS一同處理兩組細(xì)胞株0h、12 h、24、48 h后，P-gp有明顯抑制且呈時(shí)間依賴(lài)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　?。?）耐藥的乳腺癌細(xì)胞株可以富集出含量更高的腫瘤干細(xì)胞。
　　（2） DATS可以逆轉(zhuǎn)乳腺癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥作用。
　?。?） P-gp和NF-κB的高表達(dá)與乳腺癌干細(xì)胞的耐藥有關(guān)。
　?。?） DATS干預(yù)NF-κB，能夠部分抑制