Pim-2通過(guò)NF-κB通路激活A(yù)PI-5抑制肝癌細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的：探討肝癌細(xì)胞中癌基因Pim-2及其可能的下游因子NF-κB與API-5三者之間的關(guān)系，初步明確肝癌細(xì)胞中Pim-2抗凋亡的信號(hào)通路，證實(shí)Pim-2可通過(guò)NF-κB通路激活A(yù)PI-5，從而抑制肝癌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。
　　 方法：（1）收集臨床手術(shù)切除的肝細(xì)胞癌組織及相應(yīng)癌旁組織各27例，以同期行非腫瘤性肝葉切除術(shù)的正常肝組織11例為對(duì)照，設(shè)置臨床標(biāo)本實(shí)驗(yàn)組共3組：肝細(xì)胞癌組織組、癌旁組織組和正常肝組織組。（2）通

2、過(guò)Real-time PCR檢測(cè)上述各組標(biāo)本中Pim-2、NF-κB和API-5的mRNA水平；通過(guò)免疫組織化學(xué)和Western blotting分別檢測(cè)上述各組標(biāo)本中Pim-2、tAPI-5和pAPI-5的蛋白水平；通過(guò)EMSA檢測(cè)上述各組標(biāo)本中NF-κB的活性度。（3）構(gòu)建攜帶人Pim-2基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染入非腫瘤性人肝細(xì)胞L02細(xì)胞株，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞為對(duì)照；設(shè)計(jì)針對(duì)Pim-2的特異性SiRNA，導(dǎo)入真核

3、表達(dá)載體pGenesil-1，并將其轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞為對(duì)照（前期完成）。（4）設(shè)置細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組共8組：非腫瘤性人肝細(xì)胞L02細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染Pim-2的L02細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染空載體的L02細(xì)胞組、人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染Pim-2SiRNA的HepG2細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染空載體的HepG2細(xì)胞組、L02/Pim-2+銀膠菊內(nèi)酯（NF-κB信號(hào)通路特異性抑制劑）組、HepG2+銀膠菊內(nèi)酯組。（5）通過(guò)

4、Real-time PCR檢測(cè)上述各組細(xì)胞中Pim-2，NF-κB和API-5的mRNA水平；通過(guò)Western blotting檢測(cè)上述各組細(xì)胞中Pim-2，tAPI-5和pAPI-5的蛋白水平；通過(guò)EMSA檢測(cè)上述各組細(xì)胞核蛋白中NF-κB的活性度；通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)上述各組細(xì)胞的凋亡率。
　　 結(jié)果：（1）臨床標(biāo)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：肝癌組織中Pim-2、NF-κB和API-5的mRNA水平較癌旁組織和正

5、常肝組織中顯著增高（p<0.05）；肝癌組織中Pim-2、tAPI-5和pAPI-5蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)，而癌旁組織和正常肝組織中呈陰性表達(dá)；肝癌組織中Pim-2、tAPI-5和pAPI-5的蛋白水平較癌旁組織和正常肝組織中顯著增高（p<0.05）；肝癌組織中NF-κB活性度較癌旁組織和正常肝組織中顯著增高（p<0.05）。（2）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染Pim-2的L02細(xì)胞中Pim-2的mRNA和蛋白水平較對(duì)照組顯著增高（p<0.05）；轉(zhuǎn)染Pi

6、m-2 SiRNA的HepG2細(xì)胞中Pim-2的mRNA和蛋白水平較對(duì)照組顯著降低（p<0.05）。在各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中，NF-κB和API-5的mRNA水平隨著Pim-2 mRNA水平的變化而平行變化；tAPI-5和pAPI-5的蛋白水平及NF-κB活性度也隨著Pim-2蛋白水平的變化而平行變化。在高表達(dá)Pim-2的L02/Pim-2細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中加入NF-κB特異性抑制劑銀膠菊內(nèi)酯后，Pim-2 mRNA及蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化，但

7、其中NF-κB、API-5的mRNA水平，pAPI-5和tAPI-5的蛋白水平及NF-κB活性度均顯著降低（p<0.05）。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率與Pim-2的表達(dá)水平無(wú)直接關(guān)系，而與pAPI-5的水平呈反向平行變化趨勢(shì)。
　　 結(jié)論：（1）臨床標(biāo)本實(shí)驗(yàn)提示：Pim-2、NF-κB和API-5可能是與肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的某信號(hào)通路上的相關(guān)因子。（2）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)：Pim-2可通過(guò)磷酸化作用激活A(yù)PI-5從而抑制肝癌細(xì)胞凋亡，而N