膜聯(lián)蛋白A1通過與IKKγ作用激活NF-κB通路調(diào)控miR-26a對非小細(xì)胞肺癌侵襲和遷移的影響.pdf

1、目的:
　　肺癌是目前全球最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率居腫瘤首位，并有逐年上升的趨勢，轉(zhuǎn)移是造成肺癌患者死亡的主要原因。肺癌的轉(zhuǎn)移機制十分復(fù)雜，是一個多基因、多步驟、多階段的生物學(xué)過程，其中涉及到多種癌基因的激活及抑癌基因的失活。因此，深入研究肺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的分子機制具有非常重要的意義。
　　DAL-1(Differentially expressed in Adenocarcinoma of the

2、Lung)是一個抑癌基因，我們前期工作已證明其能明顯抑制肺癌細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜分析鑒定證明ANXA1是DAL-1相關(guān)蛋白，在肺癌組織中呈現(xiàn)高表達，與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)；利用生物信息學(xué)技術(shù)結(jié)合轉(zhuǎn)移相關(guān)基因芯片分析篩選出miR-26a對DAL-1有調(diào)控作用，并證明了miR-26a在肺癌組織中發(fā)揮抑癌基因的作用，具有抑制肺癌細(xì)胞侵襲和遷移的功能。有研究報道，ANXA1可激活NF-κB通路促進乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；在心肌

3、成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中p65可負(fù)向調(diào)控miR-26a的表達，由此提示ANXA1促進肺癌轉(zhuǎn)移的作用可能部分是通過ANXA1-NF-κB-miR-26a調(diào)控通路得以實現(xiàn)的。本研究擬對此假設(shè)加以證明，從而為進一步闡明肺癌轉(zhuǎn)移機制補充新的內(nèi)容，為尋找肺癌轉(zhuǎn)移標(biāo)志物和潛在治療靶點提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　一、非小細(xì)胞肺癌中ANXA1表達水平的檢測
　　1、利用免疫印跡(western blot)和實時熒光定量PCR(qRT

4、-PCR)方法檢測在非小細(xì)胞肺癌癌組織、配對癌旁組織中ANXA1的表達情況。
　　2、利用western blot和qRT-PCR方法檢測非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中ANXA1的表達情況。
　　二、ANXA1對非小細(xì)胞肺癌生物學(xué)行為的影響
　　1、建立穩(wěn)定干擾ANXA1的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株：將干擾ANXA1慢病毒載體分別感染A549和H1299細(xì)胞株，實驗分六組：LV-ANXA1-RNAi（實驗組）、LV-ANXA1-RNAi

5、-con（空載體組）、A549（空白對照組）和H1299（空白對照組）。將干擾ANXA1的慢病毒(LV-ANXA1-RNAi)分別感染A549和H1299細(xì)胞后，通過96孔板有限稀釋法挑選陽性單克隆細(xì)胞，命名為ANXA1 siRNA，通過western blot方法鑒定穩(wěn)定干擾ANXA1細(xì)胞株的建立。
　　2、建立干擾后再過表達ANXA1的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株：實驗分三組：LV-ANXA1（實驗組）、LV-ANXA1-con（空載體

6、組）和A549-ANXA1 siRNA（空白對照組）。將過表達ANXA1的慢病毒載體(LV-ANXA1)感染A549-ANXA1 siRNA細(xì)胞，通過96孔板有限稀釋法挑選陽性單克隆細(xì)胞，命名為A549-si-ANXA1/ANXA1，通過western blot方法鑒定過表達ANXA1細(xì)胞株的建立。
　　3、利用CCK-8細(xì)胞增殖、細(xì)胞劃痕及Transwell和Boyden實驗檢測穩(wěn)定干擾和過表達ANXA1后對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長

7、、侵襲及遷移的影響。
　　三、p65對miR-26a表達調(diào)控的研究
　　1、通過western blot和qRT-PCR方法檢測非小細(xì)胞肺癌癌組織、配對癌旁組織中p65的表達情況。
　　2、抑制A549細(xì)胞中p65活性對miR-26a表達的影響：實驗分為三組：A549-SN50（實驗組）、A549-DMSO（實驗對照組）及A549（空白對照組）。利用核漿蛋白分離試劑盒分離胞漿和胞核蛋白及western blot方法檢測

8、胞漿中總p65和胞核中P-p65的表達，qRT-PCR檢測miR-26a的表達情況。
　　3、抑制干擾后再過表達ANXA1細(xì)胞中p65活性對miR-26a表達的影響：實驗分為三組：A549-si-ANXA1/ANXA1-SN50（實驗組）、A549-si-ANXA1/ANXA1-DMSO（實驗對照組）和干擾后再過表達ANXA1(A549-si-ANXA1/ANXA1)（空白對照組）。利用核漿蛋白分離及western blot方法檢

9、測胞漿中總p65和胞核中P-p65的表達，qRT-PCR檢測miR-26a的表達情
　　況。
　　四、ANXA1-NF-κB-miR-26a通路對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響
　　1、ANXA1對NF-κB通路的調(diào)節(jié)作用
　　1）干擾ANXA1表達對NF-κB信號通路分子表達的影響：實驗分為三組：A549-ANXA1 siRNA（實驗組）、A549-ANXA1 siRNA-con（空載體組）和A549（空

10、白對照組）。利用核漿蛋白分離和western blot方法檢測干擾ANXA1細(xì)胞中IKKα/β、IKKγ、IKBα、p65和P-IKKα/β、P-IKKγ、P-IKBα、P-p65的表達變化。
　　2）干擾后再過表達ANXA1對NF-κB信號通路分子表達的影響：實驗分為三組：A549-si-ANXA1/ANXA1（實驗組）、A549-si-ANXA1/ANXA1-con（空載體組）和ANXA1 siRNA（空白對照組）。利用核漿蛋

11、白分離和western blot方法檢測過表達ANXA1細(xì)胞中IKKα/β、IKKγ、IKBα、p65和P-IKKα/β、P-IKKγ、P-IKBα、P-p65的表達變化。
　　2、ANXA1是否通過調(diào)節(jié)NF-κB/IKKγ影響miR-26a的表達及生物學(xué)行為的影響
　　1）通過qRT-PCR方法檢測干擾和過表達ANXA1細(xì)胞中miR-26a的表達情況。
　　2）利用Pearson相關(guān)性分析7種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中AN

12、XA1、p65及miR-26a的表達相關(guān)性。
　　3）A549細(xì)胞中IKKγ在ANXA1調(diào)控miR-26a表達中的作用：實驗分為三組：A549-IKK-16（IKKγ抑制劑）（實驗組）、A549-DMSO（實驗對照組）和A549（空白對照組）。利用western blot方法檢測細(xì)胞中IKKγ和P-IKKγ的表達， qRT-PCR方法檢測miR-26a的表達情況。
　　4）干擾后再過表達ANXA1細(xì)胞中IKKγ在ANXA1調(diào)

13、控miR-26a表達中的作用：實驗分為三組：A549-si-ANXA1/ANXA1-IKK-16（IKKγ抑制劑）（實驗組）、A549-si-ANXA1/ANXA1-DMSO（實驗對照組）和A549-si-ANXA1/ANXA1（空白對照組）。利用western blot方法檢測細(xì)胞中IKKγ和P-IKKγ的表達，qRT-PCR方法檢測miR-26a的表達情況。
　　5）ANXA1-NF-κB-miR-26a通路對非小細(xì)胞肺癌侵襲

14、和遷移能力的影響抑制ANXA1表達的細(xì)胞：實驗分為三組：ANXA1 siRNA-IKK-16（實驗組）、ANXA1 siRNA-SN50（實驗組）和ANXA1 siRNA（空白對照組）。通過Transwell和Boyden實驗檢測分別抑制細(xì)胞中IKKγ和p65活性后對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲及遷移的影響。
　　過表達ANXA1的細(xì)胞：實驗分為三組：A549-si-ANXA1/ANXA1-IKK-16（實驗組）、A549-si-ANXA

15、1/ANXA1-SN50（實驗組）和A549-si-ANXA1/ANXA1（空白對照組）。通過Transwell和Boyden實驗檢測分別抑制細(xì)胞中IKKγ和p65活性后對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲及遷移的影響。
　　結(jié)果:
　　一、非小細(xì)胞肺癌中ANXA1表達水平的檢測
　　1、非小細(xì)胞肺癌組織中ANXA1表達水平的檢測Western blot和qRT-PCR結(jié)果顯示在11對新鮮配對的腫瘤組織中ANXA1 mRNA和蛋白表

16、達水平高于相配對的癌旁正常組織。
　　2、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中ANXA1表達水平的檢測Western blot和qRT-PCR方法檢測6種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株ANXA1 mRNA和蛋白的表達情況，結(jié)果顯示，以16HBE為對照，ANXA1在A549、H460、H1299、95D和PAa細(xì)胞中表達明顯上調(diào)，H520細(xì)胞中表達明顯下調(diào)。
　　二、ANXA1對非小細(xì)胞肺癌生物學(xué)行為的影響
　　1、構(gòu)建ANXA1過表達和干擾病毒載

17、體，建立穩(wěn)定表達細(xì)胞株利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建ANXA1干擾和過表達病毒載體，測序結(jié)果顯示構(gòu)建成功；將ANXA1過表達和干擾病毒載體分別感染非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，western blot檢測結(jié)果顯示，成功建立穩(wěn)定干擾和過表達ANXA1的細(xì)胞株，用于下一步實驗。
　　2、干擾ANXA1表達對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　1）LV-ANXA1-RNAi和LV-ANXA1-RNAi-con感染A549細(xì)胞，CCK-8細(xì)胞增殖實驗

18、結(jié)果顯示，與A549-ANXA1 siRNA-con（空載體組）和A549（空白對照組）相比，干擾ANXA1（實驗組）細(xì)胞生長能力明顯減弱(P<0.05)，空載體組和空白對照組組間相比無明顯差異(P>0.05)。
　　2）LV-ANXA1-RNAi和LV-ANXA1-RNAi-con感染H1299細(xì)胞，CCK-8細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示，與H1299-ANXA1 siRNA-con（空載體組）和H1299（空白對照組）相比，干擾ANX

19、A1（實驗組）細(xì)胞生長能力明顯減弱(P<0.05)，空載體組和空白對照組組間相比無明顯差異(P>0.05)。以上結(jié)果說明干擾ANXA1表達抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。
　　3）細(xì)胞劃痕、Transwell及Boyden實驗結(jié)果顯示，與A549-ANXA1 siRNA-con（空載體組）和A549（空白對照組）相比，干擾ANXA1（實驗組）細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯被抑制(P<0.05)，空載體組和空白對照組組間相比無明顯差異(P>0.

20、05)。
　　4）細(xì)胞劃痕、Transwell及Boyden實驗結(jié)果顯示，與H1299-ANXA1 siRNA-con（空載體組）和H1299（空白對照組）相比，干擾ANXA1（實驗組）細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯被抑制(P<0.05)，空載體組和空白對照組組間相比無明顯差異(P>0.05)，以上結(jié)果說明干擾ANXA1表達明顯抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。
　　3、過表達ANXA1對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響1）將慢病毒

21、LV-ANXA1和LV-ANXA1-con分別感染ANXA1 siRNA細(xì)胞， CCK-8細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示，與A549-si-ANXA1/ANXA1-con（空載體組）和ANXA1 siRNA（空白對照組）相比，干擾后再過表達ANXA1（實驗組）細(xì)胞生長能力顯著增強(P<0.01)，空載體組和空白對照組組間相比無明顯差異(P>0.05)，說明過表達ANXA1促進非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。
　　2）細(xì)胞劃痕、Transwell和B

22、oyden實驗結(jié)果顯示，與A549-si-ANXA1/ANXA1-con（空載體組）和ANXA1 siRNA（空白對照組）相比，干擾后再過表達ANXA1（實驗組）細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力明顯增強(P<0.05)，空載體組和空白對照組組間相比無明顯差異(P>0.05)，表明過表達ANXA1促進非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。
　　三、p65對miR-26a表達調(diào)控的研究
　　1、非小細(xì)胞肺癌組織中p65總蛋白表達水平的檢測Wester

23、n blot和qRT-PCR方法檢測10對新鮮配對非小細(xì)胞肺癌組織中p65總蛋白的表達，結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中p65總蛋白的表達高于配對癌旁正常組織。
　　2、p65對miR-26a表達的調(diào)控作用
　　Western blot和qRT-PCR結(jié)果顯示，與A549-DMSO（實驗對照組）和A549（空白對照組）為參照，抑制A549細(xì)胞中p65活性后，胞漿中總p65表達無明顯變化(P>0.05)，胞核中P-p65表達明顯下

24、調(diào)(P<0.05)，miR-26a的表達明顯升高(P<0.05)，實驗對照組和空白對照組組間比較無明顯差異(P>0.05)。
　　以A549-si-ANXA1/ANXA1-DMSO（實驗對照組）和A549-si-ANXA1/ANXA1（空白對照組）為對照，干擾后再過表達ANXA1(A549-si-ANXA1/ANXA1-SN50)（實驗組）胞漿中總p65表達無明顯變化(P>0.05)，胞核中P-p65表達明顯下調(diào)(P<0.05)，

25、miR-26a的表達明顯升高(P<0.05)，實驗對照組和空白對照組組間比較無明顯差異(P>0.05)。
　　四、ANXA1-NF-κB-miR-26a通路對非小細(xì)胞肺癌侵襲和遷移能力的影響
　　1、ANXA1對NF-κB通路的調(diào)節(jié)作用
　　1）干擾ANXA1表達對NF-κB信號通路分子表達的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，以A549-ANXA1 siRNA-con（空載體組）和A549（空白對照組）為對照，

26、干擾ANXA1（實驗組）細(xì)胞中總IKKα/β和P-IKKα/β無明顯變化(P>0.05)，P-IKKγ、P-IKBα、P-p65的表達均顯著下降(P<0.05)，而胞漿中總的IKKγ、IKBα、p65的表達無明顯變化(P>0.05)，空載體組和空白對照組組間比較無明顯差異(P>0.05)。
　　2）干擾后再過表達ANXA1對NF-κB信號通路分子表達的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，以A549-si-ANXA1/ANXA

27、1-con（空載體組）和ANXA1 siRNA（空白對照組）為參照，干擾后再過表達ANXA1（實驗組）細(xì)胞胞漿總IKKα/β和P-IKKα/β無明顯變化(P>0.05)，P-IKKγ、P-IKBα、P-p65的表達均顯著增加(P<0.05)，胞漿中總的IKKγ、IKBα、p65的表達未發(fā)生明顯變化(P>0.05)，空載體組和空白對照組組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　2、ANXA1對miR-26a表達的影響
　　1

28、）qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，以A549-ANXA1 siRNA-con（空載體組）和A549（空白對照組）為對照，干擾ANXA1（實驗組）細(xì)胞中miR-26a表達明顯上調(diào)(P<0.05)，空載體組和空白對照組組間比較無明顯差異(P>0.05)。
　　2）以A549-si-ANXA1/ANXA1-con（空載體組）和ANXA1 siRNA（空白對照組）為參照，干擾后再過表達ANXA1（實驗組）細(xì)胞中miR-26a表達明顯下降(P<

29、0.05)，空載體組和空白對照組組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　3、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中ANXA1、p65、miR-26a三者的表達相關(guān)性Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，在7種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中ANXA1與miR-26a（r=-0.81，P=0.0272）和p65與miR-26a（r=-0.793，P=0.0333）的表達水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；ANXA1與p65（r=0.825，P=0.0224）的表達水平呈正相關(guān)關(guān)系。

30、
　　4、IKKγ在ANXA1調(diào)控miR-26a表達中的作用
　　通過核漿蛋白分離、western blot和qRT-PCR方法檢測結(jié)果顯示，以A549-DMSO（實驗對照組）和A549（空白對照組）為參照，抑制A549細(xì)胞中IKKγ活性后，胞漿中總的IKKγ、IKBα、p65的表達無明顯變化(P>0.05)，P-IKKγ、P-IKBα、P-p65的表達顯著下降(P<0.05)，miR-26a表達明顯上調(diào)(P<0.05)，實

31、驗對照組和空白對照組組間比較無明顯差異(P>0.05)。同樣，在干擾后再過表達ANXA1的細(xì)胞中，以A549-si-ANXA1/ANXA1-DMSO（實驗對照組）和A549-si-ANXA1/ANXA1（空白對照組）組為對照，干擾后再過表達ANXA1的細(xì)胞中抑制IKKγ活性后，胞漿中總的IKKγ、IKBα、p65的表達無明顯變化(P>0.05)，P-IKKγ、P-IKBα、P-p65的表達顯著下降(P<0.05)，miR-26a表達明顯

32、增加(P<0.05)，實驗對照組和空白對照組組間比較無明顯差異(P>0.05)。
　　5、ANXA1-NF-κB-miR-26a通路對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響Transwell和Boyden實驗結(jié)果顯示：在干擾ANXA1細(xì)胞中，與ANXA1 siRNA（空白對照組）相比，ANXA1 siRNA-IKK-16（實驗組）和ANXA1 siRNA-SN50（實驗組）細(xì)胞侵襲和遷移的細(xì)胞數(shù)量較空白對照組顯著減少(P<0.05)。在

33、干擾后再過表達ANXA1細(xì)胞中，以A549-si-ANXA1/ANXA1（干擾后再過表達ANXA1細(xì)胞）（空白對照組）為參照， A549-si-ANXA1/ANXA1-IKK-16（實驗組）和siRNA-LV-ANXA1-SN50（實驗組）細(xì)胞侵襲(P<0.05)和遷移(P<0.01)能力較空白對照組相比明顯減弱。
　　結(jié)論:
　　1、ANXA1在非小細(xì)胞肺癌中高表達，可促進非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，發(fā)揮癌基因作用