沉默NF-κB通路IKKβ、p65基因?qū)p感染過表達(dá)FAF1胃癌細(xì)胞的調(diào)控作用研究.pdf

1、目的：
　　探討核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)傳導(dǎo)通路中IKKβ、p65基因沉默后對(duì)過表達(dá)Fas相關(guān)因子1（Fas associated factor1，F(xiàn)AF1）的HGC-27胃癌細(xì)胞的影響，以及NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路在幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染相關(guān)性胃癌中的作用，從而明確Hp感染相關(guān)性胃癌中FAF1與NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路之間的關(guān)系。
　　方法：

2、>　　構(gòu)建針對(duì)IKKβ、p65的siRNA慢病毒表達(dá)載體（LV-IKKβ-RNAi、LV-p65-RNAi），轉(zhuǎn)染過表達(dá)FAF1的HGC-27胃癌細(xì)胞株（Lenti-FAF1/HGC-27），實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后IKKβ、p65、FAF1 mRNA和蛋白表達(dá)水平變化。應(yīng)用CCK8法檢測(cè)siRNA慢病毒轉(zhuǎn)

3、染后細(xì)胞增殖能力的變化。用Hp培養(yǎng)濾液感染經(jīng)siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用qRT-PCR和Western blot法檢測(cè)Hp感染前后IKKβ、p65、FAF1 mRNA和蛋白表達(dá)水平變化。進(jìn)一步采用Western blot法檢測(cè)Hp感染后NF-κB信號(hào)通路上IKKα/β、p65、IκBα及其相應(yīng)磷酸化基因（P-IKKα/β，P-p65，P-IκBα）蛋白表達(dá)水平變化，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorben

4、t assay，ELISA）檢測(cè)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-8（interleukin-8，IL-8）等炎性細(xì)胞因子濃度變化。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建siRNA慢病毒表達(dá)載體LV-IKKβ-RNAi、LV-p65-RNAi和LV-NC-RNAi，測(cè)序結(jié)果表明，構(gòu)建的重組序列是正確的。
　　2.成功包裝出所需要的慢病毒濃縮液，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后可見大量紅色熒

5、光產(chǎn)生。熒光法測(cè)定慢病毒滴度結(jié)果顯示LV-IKKβ-RNAi滴度為3×108TU/ml，LV-p65-RNAi滴度為6×108TU/ml，LV-NC-RNAi滴度為5×108TU/ml。
　　3．細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染針對(duì)IKKβ和p65的siRNA慢病毒后，LV-IKKβ-RNAi和LV-p65-RNAi組細(xì)胞原有的梭形形態(tài)變成不規(guī)則形，而空載轉(zhuǎn)染組（LV-NC-RNAi）細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化。轉(zhuǎn)染后72 h，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率達(dá)

6、到90％。
　　4．細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染針對(duì)IKKβ和p65的siRNA慢病毒后，LV-IKKβ-RNAi和LV-p65-RNAi組IKKβ和p65 mRNA表達(dá)顯著低于LV-NC-RNAi組和未轉(zhuǎn)染組（P均＜0.01）。LV-NC-RNAi組與未轉(zhuǎn)染組IKKβ、p65 mRNA表達(dá)無顯著差異（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染siRNA慢病毒后，各組間FAF1 mRNA表達(dá)無顯著差異（P＞0.05）。
　　5. Hp培養(yǎng)濾液感染后，LV-NC-

7、RNAi組和未轉(zhuǎn)染組IKKβ、p65 mRNA和蛋白表達(dá)都顯著高于感染前（P＜0.01），而FAF1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著低于感染前（P＜0.01）；Hp感染后LV-IKKβ-RNAi組和LV-p65-RNAi組IKKβ、p65、FAF1 mRNA和蛋白表達(dá)與感染前相比無顯著差異（P＞0.05）。
　　6. CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與LV-NC-RNAi組和未轉(zhuǎn)染組相比，LV-IKKβ-RNAi組和LV-p65-RNAi組細(xì)胞增殖

8、水平明顯升高（P＜0.01），LV-NC-RNAi組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖水平無顯著差異（P＞0.05）。
　　7. Hp培養(yǎng)濾液感染后，LV-IKKβ-RNAi、LV-p65-RNAi組NF-κB信號(hào)通路上IKKα/β、p65蛋白表達(dá)顯著低于未轉(zhuǎn)染組和LV-NC-RNAi組（P＜0.05），IκBα蛋白表達(dá)顯著高于未轉(zhuǎn)染組和LV-NC-RNAi組（P＜0.05）；磷酸化IKKα/β、p65、IκBα（P-IKKα/β，P-p65，P

9、-IκBα）蛋白表達(dá)顯著低于未轉(zhuǎn)染組和LV-NC-RNAi組（P＜0.05）。LV-NC-RNAi組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞蛋白水平無顯著差異（P＞0.05）。
　　8. Hp培養(yǎng)濾液感染后，LV-IKKβ-RNAi、LV-p65-RNAi組炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-8濃度顯著低于未轉(zhuǎn)染組和LV-NC-RNAi組（P＜0.01）。LV-NC-RNAi組與未轉(zhuǎn)染組TNF-α、IL-8表達(dá)無顯著差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：