IKKβ誘導表達及其介導的TFF3激活NF-κB通路機制初探.pdf

1、腸三葉因子3（TrefoilFactor3，TFF3）是三葉因子家族的成員，廣泛表達于哺乳動物的多種組織，對粘膜上皮有保護和修復作用，是一種調(diào)節(jié)性小肽。有研究表明，在炎癥、癌癥等病理狀態(tài)下，TFF3的表達上調(diào)。TFF3除了作為一種粘膜保護肽，對上皮組織起到修復損傷作用外，近期發(fā)現(xiàn)它參與包括NF-κB等信號通路的調(diào)節(jié)。
　　 核因子κB（NuclearFactor-kappaB，NF-κB），作為核轉錄因子，介導環(huán)境刺激，也做為一

2、種關鍵的信號中樞調(diào)節(jié)多種病理、生理反應。研究表明NF-κB參與調(diào)節(jié)多種涉及固有免疫和適應性免疫相關的細胞因子、生長因子和酶效應子的表達，包括T細胞受體、B細胞受體、TNFR、CD40、BAFFR、LTβR以及Toll/IL-1R家族成員。體內(nèi)外的多種刺激通過不同的受體、受體近端分子、接頭蛋白（如TRAFs、RIPs）等分子的介導，激活上游激酶復合物IKKs，從而引起抑止子IκBs的磷酸化、降解，釋放出游離的NF-κB調(diào)節(jié)一系列靶基因的表

3、達。不同的刺激因素可能以刺激特異性方式誘導IKKs復合物的激活，活化NF-κB通路。
　　 TFF3調(diào)節(jié)的NF-κB信號通路分子可能成為治療免疫炎癥相關疾病的新靶點，因此，明確TFF3激活NF-κB信號途徑的分子機制具有非常重要的理論和臨床意義。本研究報道了TFF3可能調(diào)節(jié)的NF-κB上游IκB激酶復合物亞基分子的變化，為明確TFF3激活NF-κB轉導通路的調(diào)節(jié)機制提供了新的依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 1.

4、pGEX-5x-1-IKKβ載體構建及原核表達、純化
　　 以M6P8載體為模板，PCR獲得IKKβ片段。用T4DNA連接酶，在4℃下進行酶切后的DNA片段和載體的連接反應。連接產(chǎn)物被轉化至DH5α菌株中培養(yǎng)過夜。挑取單克隆，提取質粒、酶切鑒定，并測序。
　　 將重組質粒轉化至BL21細菌中，培養(yǎng)過夜，第二天以1:100接種至200mlLB，培養(yǎng)至OD600值至0.6-1.0，提取細菌蛋白，并純化。
　　 2.p

5、EGFP-TFF3重組載體的構建
　　 提取細胞RNA后RT-PCR獲得hTFF3片段，酶切后連接至pEGFP載體中，酶切、測序鑒定。
　　 3.TFF3誘導下對IKKβ的表達調(diào)節(jié)作用
　　 轉染pEGF-TFF3載體，以RT-PCR、WesternBlot檢測IKKβ在TFF3誘導前后的表達變化。
　　 結果：
　　 1.IKKβ蛋白在原核細胞中的表達純化
　　 SDS-PAGE凝膠電泳

6、檢測IPTG誘導E.coliBL21蛋白表達，在73kD處純化得到融合蛋白條帶，與預期的蛋白分子量一致。
　　 2.pEGFP-C1-TFF3、pGEX-5x-1-IKKβ重組載體的構建及鑒定
　　 構建了pEGFP-C1-TFF3、pGEX-5x-1-IKKβ重組載體，經(jīng)雙酶切、測序結果顯示酶切結果與預期片段分子量一致，測序結果與GenBank中TFF3、IKKβ的基因序列一致，證實載體構建成功。
　　 3.T

7、FF3調(diào)節(jié)IKKβ分子在轉錄和翻譯水平的表達
　　 發(fā)現(xiàn)IKKβ分子在轉錄和翻譯水平均的表達受TFF3調(diào)節(jié)。
　　 結論：
　　 TFF3調(diào)節(jié)IκB激酶亞基分子IKKβ的表達，提示IKKβ分子參與TFF3激活的NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)，結果為TFF3在激活NF-κB中的作用提供了新的線索。本實驗構建了pEGFP-C1-TFF3及p6EX-5x-1-IKKβ重組載體，并在原核細胞內(nèi)實現(xiàn)了IKKβ分子的表達和純化，為