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文檔簡介
1、目的:
1.探討HBV是否能誘導(dǎo)肝細(xì)胞分泌趨化因子MIG,以及篩選HBV編碼的七個蛋白中能顯著影響MIG表達(dá)的蛋白。
2.探討HBx在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控MIG表達(dá)的詳細(xì)分子機(jī)制,篩選出HBx激活的核轉(zhuǎn)錄因子。
3.探討HBx蛋白誘導(dǎo)的MIG是否具有趨化體外培養(yǎng)活化PBL的生物學(xué)功能。
方法:
一. HBV能否誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分泌MIG:
1.將包含HBV全基因組的
2、質(zhì)粒pBlue-HBV轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞,RT-PCR和ELISA檢測MIG表達(dá)變化。
2.將包含了HBV編碼的七個基因的質(zhì)粒pCMV-S,pCMV-preS1,pCMV-preS2,pCMV-Hbe,pCMV-HBc,pCMV-HBx,pCMV-HBp分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞,RT-PCR和ELISA檢測MIG表達(dá)變化。
3.構(gòu)建包含MIG全長啟動子的報告基因質(zhì)粒(-983/+33)MIG,與HBV七個基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染肝癌
3、細(xì)胞,熒光素酶技術(shù)檢測MIG啟動子活性變化。
4.將(-983/+33)MIG與不同劑量pCMV-HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞,熒光素酶技術(shù)檢測不同劑量的HBx蛋白激活MIG基因啟動子的水平。
二. HBx誘導(dǎo)MIG表達(dá)的分子機(jī)制:
1.構(gòu)建系列截短的MIG啟動子報告基因質(zhì)粒(-495/+33)MIG,(-185/+33)MIG,(-129/+33)MIG,與pCMV-HBx共轉(zhuǎn)染,熒光素酶技術(shù)分析
4、MIG啟動子活性變化。
2.分別突變NF-κB兩個結(jié)合位點(diǎn),構(gòu)建突變質(zhì)粒NF-κB1 MUT,NF-κB2 MUT,與pCMV-HBx共轉(zhuǎn)染,熒光素酶技術(shù)分析突變MIG啟動子活性變化。
3.將pCMV-HBx與 (-985/+33)MIG共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后,用不同濃度的MG-132(NF-κB抑制劑)處理細(xì)胞,檢測MIG啟動子活性變化。
4.將NF-κB亞基p65和p50表達(dá)質(zhì)粒pCMV-p
5、65、pCMV-p50分別與(-495/+33)MIG或者NF-κB2 MUT共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,熒光素酶技術(shù)檢測MIG啟動子活性變化,ELISA檢測MIG蛋白表達(dá)的變化。將pCMV-HBx轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后不同時間點(diǎn)收集細(xì)胞,分別提取胞質(zhì)以及核內(nèi)的總蛋白,Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測p65在核內(nèi)和核外的表達(dá)變化;另外,采用FITC標(biāo)記的二抗處理和DAPI染細(xì)胞核,激光共聚焦顯微鏡觀察p65在胞漿和核內(nèi)表達(dá)變化。
6、5.將pCMV-HBx或pCMV-tag2轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后,獲得細(xì)胞核抽提物,用濃度為標(biāo)記探針100倍的未標(biāo)記探針作為競爭劑進(jìn)行競爭實(shí)驗(yàn),EMSA和ChIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NF-κB是否能直接與MIG啟動子上NF-κB位點(diǎn)結(jié)合。
三.HBx誘導(dǎo)產(chǎn)生的MIG對體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的趨化作用:
1.將pCMV-HBx和空載體pCMV-Tag2分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,48 h后分別取細(xì)胞分泌上清,通過趨化實(shí)驗(yàn)檢測分泌產(chǎn)物對
7、PBL遷移的影響。
2.將pCMV-HBx轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后,加入10μM MG-132處理細(xì)胞,取細(xì)胞分泌上清,通過趨化實(shí)驗(yàn)檢測分泌產(chǎn)物對PBL遷移的影響。
3.將pCMV-p65、pCMV-p50分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,或?qū)CMV-p65、pCMV-p50共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,取細(xì)胞培養(yǎng)上清通過趨化實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞分泌產(chǎn)物對PBL遷移的影響。
4.分別轉(zhuǎn)染pCMV-Tag2、pCMV-H
8、Bx、pCMV-p65、pCMV-p50,或?qū)CMV-p65、pCMV-p50共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。取細(xì)胞培養(yǎng)上清加入10 μg抗MIG的抗體中和MIG表達(dá),然后通過趨化實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞分泌產(chǎn)物對PBL遷移的影響。
結(jié)果:
一.HBV誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分泌MIG:
1.與空載體組相比,轉(zhuǎn)染pBlue-HBV后肝癌細(xì)胞中MIG的mRNA水平顯著上調(diào),分泌的MIG蛋白量顯著增加。
2.HB
9、V七個功能蛋白S,preS1,preS2,Hbe,HBc,HBx以及P蛋白中,僅有HBx蛋白可以明顯地誘導(dǎo)趨化因子MIG表達(dá),S蛋白亦可以輕度激活MIG表達(dá),其他HBV蛋白對MIG表達(dá)幾乎沒有任何影響。
3.HBV七個功能蛋白中,僅有HBx蛋白可以明顯地激活趨化因子MIG啟動子活性,與空載體組相比,轉(zhuǎn)染pCMV-HBx后MIG啟動子活性增加3.45倍;其他蛋白對MIG基因啟動子活性幾乎沒有任何影響。
4.隨著
10、HBx蛋白表達(dá)量的增加,MIG啟動子的活性隨之增加。
二. HBx誘導(dǎo)MIG表達(dá)的分子機(jī)制:
1.分別以共轉(zhuǎn)染空載體pCMV-Tag2和報告基因細(xì)胞內(nèi)MIG啟動子活性為100%,HBx蛋白激活(-985/+33)MIG的活性達(dá)3.64倍,而截短的MIG啟動子(-495/+33)MIG,(-185/+33)MIG,(-129/+33)MIG活性分別達(dá)3.81,4.09,1.30倍。由于截短掉-185--129后
11、,HBx蛋白對MIG啟動子的激活能力大大降低,因此,初步推斷-185--129位點(diǎn)在HBx蛋白誘導(dǎo)MIG表達(dá)的過程中起重要作用。
2.HBx蛋白可以激活野生型MIG啟動子(-495/+33)MIG的活性達(dá)3.48倍,而突變的MIG啟動子NF-κB1 MUT,NF-κB2 MUT和c/eBP MUT活性分別達(dá)3.12,1.43,2.78倍。由于突變掉NF-κB2結(jié)合位點(diǎn)后,HBx蛋白對MIG啟動子的激活能力大大降低,因此推斷
12、NF-κB2結(jié)合位點(diǎn)在HBx蛋白誘導(dǎo)MIG表達(dá)的過程中起到重要作用。
3.HBx蛋白可以明顯地激活MIG啟動子活性,但是隨著加入的MG-132量的增加,這種激活現(xiàn)象被明顯的抑制,當(dāng)MG-132的濃度增加到25 uM時,其誘導(dǎo)作用幾乎消失。
4.與空載體組相比,分別轉(zhuǎn)染pCMV-p65、pCMV-p50后,MIG啟動子活性分別增高2.6和3.4倍;同時轉(zhuǎn)染pCMV-p65、pCMV-p50后,MIG啟動子活性增
13、高5.8倍。然而,轉(zhuǎn)染pCMV-p65和pCMV-p50對突變體NF-κB2 MUT沒有任何作用。轉(zhuǎn)染pCMV-HBx后,隨著時間延長,p65在核內(nèi)的量逐漸增多,而在核外的量卻逐漸減少。激光共聚焦結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染空載體pCMV-Tag細(xì)胞內(nèi)NF-κB的p65亞基主要集中在細(xì)胞質(zhì)中,而轉(zhuǎn)染pCMV-HBx細(xì)胞內(nèi)NF-κB的p65亞基由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)。
5.EMSA結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pCMV-HBx的樣本存在遷移帶,而轉(zhuǎn)染空載
14、體的樣本未出現(xiàn)遷移帶,說明轉(zhuǎn)染pCMV-HBx樣本中存在和標(biāo)記探針結(jié)合的蛋白;用濃度為標(biāo)記探針20倍或100倍的未標(biāo)記探針作為競爭劑進(jìn)行競爭實(shí)驗(yàn)時發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染pCMV-HBx樣本 (lane 3或lane 4)的遷移帶隨競爭劑濃度的增加則明顯減弱,說明與探針結(jié)合是特異性的;當(dāng)樣本轉(zhuǎn)染pCMV-HBx并加MG-132處理后發(fā)現(xiàn),隨抑制劑濃度增加,遷移帶則明顯減弱,說明與探針結(jié)合的蛋白是NF-κB。ChIP實(shí)驗(yàn)顯示,轉(zhuǎn)染pCMV-HBx基因的
15、樣本,當(dāng)加入p65或p50的抗體時,可以通過PCR檢測到包含有NF-κB2結(jié)合位點(diǎn)的序列,但不加入任何抗體或者加入兔IgG對照抗體并沒有檢測到目的條帶;而轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒pCMV-tag2的樣品,當(dāng)加入p65或p50的抗體時,也沒有檢測到目的條帶。
三.HBx誘導(dǎo)產(chǎn)生的MIG對體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的趨化作用:
1.轉(zhuǎn)染pCMV-HBx細(xì)胞上清的趨化活性是轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞上清趨化活性的5.19倍,說明HBx誘導(dǎo)產(chǎn)物能
16、增強(qiáng)對活化的人PBL的趨化活性。
2.加入NF-κB的抑制劑MG-132處理細(xì)胞后,分泌上清對PBL的趨化活性由5.19倍下降至1.94倍,說明NF-κB在HBx蛋白誘導(dǎo)PBL遷移的過程中起著重要作用。
3.與陰性對照相比,轉(zhuǎn)染pCMV-p65、pCMV-p50后培養(yǎng)細(xì)胞上清趨化活性分別增加3.2和4.0倍,共轉(zhuǎn)染pCMV-p65、pCMV-p50后培養(yǎng)細(xì)胞上清趨化活性增加6.9倍。由此可知,p65和p50的
17、過表達(dá)可以增加細(xì)胞分泌產(chǎn)物對PBL的趨化作用。
4.轉(zhuǎn)染空載體pCMV-Tag2的細(xì)胞加入抗MIG抗體中和分泌的MIG后,對細(xì)胞上清對PBL的趨化能力沒有影響,而轉(zhuǎn)染pCMV-HBx的細(xì)胞在加入抗MIG抗體后,分泌上清對PBL的趨化能力明顯地下降。轉(zhuǎn)染pCMV-p65、pCMV-p50的細(xì)胞,以及共轉(zhuǎn)染p65和p50蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞在加入抗MIG抗體后,分泌上清對PBL的趨化能力均明顯下降。轉(zhuǎn)染pCMV-HBx的細(xì)胞
18、經(jīng)MG-132處理后,再加入抗MIG抗體處理細(xì)胞,其趨化PBL的能力較加對照抗體的細(xì)胞對PBL的遷移能力下降并不明顯。由此可知,誘導(dǎo)分泌的趨化因子MIG在PBL的遷移中起著重要作用。
結(jié)論:
1.HBx蛋白顯著激活趨化因子MIG啟動子活性,從而上調(diào)MIG mRNA和蛋白表達(dá)的量。
2.HBx蛋白能激活NF-κB,使NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中,進(jìn)入細(xì)胞核的NF-κB可以結(jié)合在趨化因子MIG啟
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