IKIP通過(guò)靶向IKKβ負(fù)向調(diào)節(jié)NF-κB介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的表達(dá).pdf

1、機(jī)體免疫系統(tǒng)中，固有免疫在抵抗外來(lái)病原微生物感染中發(fā)揮重要的作用，固有免疫細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體(PRR)識(shí)別微生物結(jié)構(gòu)上高度保守的病原相關(guān)分子模式（PAMP），然后經(jīng)過(guò)一系列的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)調(diào)控不同效應(yīng)分子的表達(dá)。其中TOLL樣受體(Toll-like Receptors，TLRs)作為重要的模式識(shí)別受體受到廣泛的關(guān)注，用相應(yīng)的配體如LPS，PGN等刺激固有免疫細(xì)胞后，TLRs細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)TIR(Toll/IL-1 receptor ho

2、mologous region)結(jié)構(gòu)域募集MyD88，TRAF6，IKKβ等接頭分子，最終促進(jìn)NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的活化，活化的轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)的反應(yīng)原件結(jié)合后，誘導(dǎo)大量的炎性細(xì)胞因子、趨化因子等的產(chǎn)生，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。其中TLR4(Toll-like Receptor 4)和TLR2(Toll-like Receptor 2)識(shí)別LPS和PGN后可以通過(guò)活化NF-κB的方式促進(jìn)IL-6，TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)，其產(chǎn)生的炎性細(xì)

3、胞因子在清除病原微生物感染中發(fā)揮重要的作用，但是TLRs的過(guò)度活化以及相應(yīng)炎性細(xì)胞因子的過(guò)度產(chǎn)生，將引發(fā)一系列與炎癥相關(guān)的疾病，尤其是自身免疫性疾病。因此，對(duì)促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的機(jī)制研究顯得尤為重要。
　　 IκB激酶結(jié)合蛋白（IKK-interacting Protein, IKIP）是人類近期發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新分子，經(jīng)過(guò)基因剪切后形成3個(gè)轉(zhuǎn)錄體，并翻譯成相應(yīng)的蛋白分子發(fā)揮功能。有報(bào)道稱，X射線照射能促進(jìn)IKIP的表達(dá)，在內(nèi)皮細(xì)胞中

4、，p53可以調(diào)控IKIP的表達(dá)，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要功能，作者通過(guò)酵母雙雜交的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IKIP可以與NF-κB上游的激酶IKKβ結(jié)合。由于IKKβ介導(dǎo)NF-κB活化的途徑在TLRs信號(hào)通路中同樣發(fā)揮著重要作用，因此IKIP是否參與TLRs信號(hào)通路，以及是否可以通過(guò)影響IKKβ進(jìn)而調(diào)控NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)都有待進(jìn)一步研究。
　　 研究目的:
　　 1、檢測(cè)LPS，PGN等TLRs配體刺激巨噬細(xì)胞后，IKIP的表達(dá)量

5、是否發(fā)生變化;
　　 2、探討IKIP是否影響LPS，PGN等TLRs配體誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的表達(dá);
　　 3、探討IKIP調(diào)控TLRs信號(hào)通路中的NF-κB活化的分子機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 1、 LPS，PGN刺激巨噬細(xì)胞，檢測(cè)IKIP的表達(dá)。
　　 C57/B6小鼠腹腔注射淀粉(6％)，72小時(shí)后，取出誘導(dǎo)產(chǎn)生的的原代腹腔巨噬細(xì)胞(Macrophage)，經(jīng)LPS，PGN刺激0、2、4

6、、8、12、24h，Trizol方法提取RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，最后用PCR方法檢測(cè)IKIP在mRNA水平的表達(dá)變化。
　　 同樣的方法取出巨噬細(xì)胞后，用LPS，PGN刺激相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，然后收取蛋白，用western-blot的方法檢測(cè)IKIP蛋白水平的表達(dá)變化。
　　 2、檢測(cè)IKIP對(duì)促炎細(xì)胞因子的作用。
　　 2.1、轉(zhuǎn)染IKIP的siRNA后，western-blot方法檢測(cè)IKIP siRNA

7、的干擾效率
　　 將IKIP的干擾RNA(siRNA)及陰性對(duì)照干擾RNA(snRNA)轉(zhuǎn)染入人胚胎腎細(xì)胞系HEK293(Human Embryonic Kidney HEK293，HEK293)，靜置培養(yǎng)24h，再轉(zhuǎn)入Flag-IKIP表達(dá)載體，24h后收取蛋白，用BCA方法調(diào)整濃度一致，western-blot檢測(cè)IKIP蛋白水平的變化。
　　 2.2、轉(zhuǎn)染IKIP siRNA后，LPS、PGN刺激巨噬細(xì)胞，檢測(cè)促炎

8、性細(xì)胞因子的表達(dá)變化
　　 驗(yàn)證IKIP相應(yīng)的siRNA干擾效率后，選取高干擾效率的siRNA，將其轉(zhuǎn)染入腹腔巨噬細(xì)胞，48h后，用LPS刺激巨噬細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用PCR技術(shù)分析炎性細(xì)胞因子IL-6，TNF-α以及Ⅰ型干擾素mRNA水平上的表達(dá)變化。
　　 將Flag-IKIP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞系，24小時(shí)后用LPS刺激相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，RT-PCR方法檢測(cè)促炎細(xì)胞因子IL-6，TNF-α和Ⅰ型

9、干擾素的表達(dá)變化。將Flag-IKIP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293-TLR2細(xì)胞系，4小時(shí)后用PGN刺激相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，RT-PCR方法檢測(cè)促炎細(xì)胞因子IL-6，TNF-α和Ⅰ型干擾素的表達(dá)變化。
　　 3、IKIP對(duì)TLRs信號(hào)通路中NF-κB活化調(diào)控的分子機(jī)制研究。
　　 3.1、轉(zhuǎn)染Flag-IKIP表達(dá)載體和TLRs信號(hào)通路接頭分子表達(dá)載體以及NF-κB，IFN-β報(bào)告基因質(zhì)粒后，檢測(cè)NF-κB，IFN-β報(bào)告基因活性的

10、變化情況
　　 首先將Flag-IKIP表達(dá)載體和TLRs信號(hào)通路不同的接頭分子的表達(dá)載體以及NF-κ B，IFN-β報(bào)告基因質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞，24小時(shí)后，收取細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告基因的方法檢測(cè)IKIP對(duì)NF-κB報(bào)告基因活性的影響以及對(duì)IFN-β報(bào)告基因活性的影響，分析IKIP影響NF-κB活性的可能靶點(diǎn)。
　　 3.2、干擾IKIP后，Western-blot檢測(cè)NF-κB及相關(guān)內(nèi)源性蛋白分子的磷酸化情

11、況
　　 將驗(yàn)證好的siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞48h后，用LPS刺激巨噬細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，收取蛋白，調(diào)整濃度一致后，western blot方法檢測(cè)NF-κB及相關(guān)內(nèi)源性蛋白分子的磷酸化情況，進(jìn)一步確定IKIP對(duì)NF-κB通路的影響。
　　 3.3、驗(yàn)證IKIP與IKKβ的結(jié)合
　　 將Flag-IKIP表達(dá)載體與HA-IKKβ表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞系或HEK293-TLR2細(xì)胞系后，分別用LPS或者PGN刺激2

12、h，收取蛋白，通過(guò)免疫共沉淀（Immunoprecipitation，IP）方法檢測(cè)兩個(gè)分子的結(jié)合情況。
　　 3.4、IKIP對(duì)IKK復(fù)合物形成的影響。
　　 首先將Flag-IKIP表達(dá)載體與HA-IKKβ，HA-IKKα，HA-IKKγ表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞系24小時(shí)后，再用LPS刺激相應(yīng)時(shí)間后，收取蛋白，通過(guò)免疫共沉淀的方法進(jìn)一步明確IKIP與IKK復(fù)合物中IKKβ分子的結(jié)合情況。為進(jìn)一步明確作用方式，通過(guò)

13、劑量競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染不同劑量的MYC-IKIP表達(dá)載體和相同劑量的HA-IKKβ，HA-IKKγ表達(dá)載體于Hela細(xì)胞，24小時(shí)后用LPS刺激相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，收取蛋白，通過(guò)免疫共沉淀方法檢測(cè)隨著IKIP的劑量的增加，IKKβ與HA-IKKγ結(jié)合是否發(fā)生變化。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、LPS、PGN刺激巨噬細(xì)胞后，IKIP的表達(dá)量隨著刺激時(shí)間的增加發(fā)生明顯上調(diào)。
　　 C57/B6小鼠腹腔注射淀粉(6％)，72小時(shí)后

14、，取出誘導(dǎo)產(chǎn)生的的原代腹腔巨噬細(xì)胞(Macrophage)，經(jīng)LPS，PGN刺激0、2、4、8、12、24h，Trizol方法提取RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，最后用PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IKIP mRNA的表達(dá)隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而顯著增加。
　　 同樣的方法取出巨噬細(xì)胞后，用LPS，PGN刺激相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，然后收取蛋白，用western-blot的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著刺激時(shí)間的增加，IKIP蛋白水平的表達(dá)也明顯增加。結(jié)論:通過(guò)LP

15、S、PGN刺激巨噬細(xì)胞，IKIP的表達(dá)明顯上調(diào)
　　 2、IKIP抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生
　　 2.1、IKIP siRNA的干擾效果的驗(yàn)證
　　 將IKIP相應(yīng)的干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞24h后，再轉(zhuǎn)入Flag-IKIP載體，24h后收取蛋白，用BCA方法調(diào)整濃度后，western-blot檢測(cè)IKIP蛋白。IKIPsiRNA可以顯著抑制FLAG-IKIP的表達(dá)。
　　 2.2、I

16、KIP抑制促炎細(xì)胞因子的分泌
　　 將驗(yàn)證好的siRNA轉(zhuǎn)入原代腹腔巨噬細(xì)胞48小時(shí)后，再用LPS，PGN分別刺激4小時(shí)，8小時(shí)，收取細(xì)胞，提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，后用PCR分析，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，干擾IKIP后，促炎因子IL-6，TNF-α的表達(dá)明顯上調(diào)。而IFN-β無(wú)明顯的變化。
　　 把Flag-IKIP載體分別轉(zhuǎn)入Hela和HEK293-TLR2細(xì)胞24小時(shí)后，LPS刺激Hela，PGN刺激HEK293-TLR2

17、細(xì)胞，提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用PCR方法，與對(duì)照組相比，檢測(cè)促炎性細(xì)胞因子IL-6，TNF-α的表達(dá)明顯下調(diào)。而IFN-β的表達(dá)無(wú)明顯的變化。
　　 3、IKIP抑制NF-κB活性。
　　 3.1、IKIP抑制NF-κB報(bào)告基因的活性
　　 將Flag-IKIP，TLRs信號(hào)通路不同的接頭分子以及NF-κB報(bào)告質(zhì)粒，IFN-β報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，24小時(shí)后，收取細(xì)胞，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因的方法檢

18、測(cè)，與對(duì)照組相比，IKIP實(shí)驗(yàn)組可顯著降低MyD88、IKK-β所誘導(dǎo)的NF-κB報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性。對(duì)TRIF，MyD88所介導(dǎo)的IFN-β報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性沒有影響，進(jìn)一步說(shuō)明IKIP可NF-κB的活化。
　　 3.2、Western-blot檢測(cè)IKIP對(duì)NF-κB相關(guān)的內(nèi)源性蛋白的影響
　　 將驗(yàn)證好的siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞48h后，LPS分別刺激巨噬細(xì)胞30分鐘，60分鐘，收取蛋白，用BCA的方法調(diào)整蛋

19、白濃度，western blot檢測(cè)pIκB，pP65，IκBα，P65的變化，與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)干擾IKIP后，pIκB，pP65蛋白水平明顯上調(diào);I-κBα降解增加，進(jìn)一步說(shuō)明IKIP對(duì)NF-κB的活化起到抑制作用。
　　 4、IKIP通過(guò)抑制IKKγ結(jié)合IKKβ負(fù)向調(diào)控NF-κB活化
　　 4.1、IKIP結(jié)合IKKβ
　　 將Flag-IKIP與HA-IKKβ載體共同分別轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞，HEK293-T

20、LR2細(xì)胞24h后，再用LPS刺激2h，收取蛋白，免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，IP)的方法，檢測(cè)到Flag-IKIP與HA-IKKβ兩個(gè)分子的結(jié)合。結(jié)果表明，LPS刺激后可以誘導(dǎo)IKIP結(jié)合IKKβ。
　　 4.2、IKIP通過(guò)與IKKγ競(jìng)爭(zhēng)的方式結(jié)合IKKβ負(fù)向調(diào)控NF-κB活化
　　 將Flag-IKIP與HA-IKKβ，HA-IKKα，HA-IKKγ載體共同轉(zhuǎn)入Hela細(xì)

21、胞24小時(shí)后，再用LPS刺激2h，收取蛋白，通過(guò)免疫共沉淀的方法進(jìn)一步檢測(cè)到IKIP僅僅與IKK復(fù)合物中IKKβ結(jié)合，而不是與其復(fù)合物的結(jié)合。為進(jìn)一步明確結(jié)合IKKβ，IKIP的作用方式，我們又采取劑量競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染不同劑量的MYC-IKIP和相同劑量的HA-IKKβ，HA-IKKγ于Hela細(xì)胞，LPS刺激2小時(shí)后，收取蛋白，IP的方法檢測(cè)到隨著IKIP劑量的增加，與IKKβ結(jié)合的IKKγ的量減少，表明，IKIP通過(guò)與IKKγ競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合

22、IKKβ，影響IKK復(fù)合物的活性，來(lái)發(fā)揮抑制作用的。
　　 結(jié)論:
　　 1、LPS、PGN可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中IKIP的表達(dá)量。
　　 2、IKIP抑制LPS、PGN誘導(dǎo)的促炎因子及Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。
　　 3、IKIP負(fù)向調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路。
　　 4、IKIP通過(guò)與IKKγ競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IKKβ，影響IKK復(fù)合物的形成，負(fù)向調(diào)控NF-κB的活性，發(fā)揮抑制炎癥過(guò)度反應(yīng)的作用。
　　 創(chuàng)新點(diǎn)