IKIP通過靶向IKKβ負向調(diào)節(jié)NF-κB介導(dǎo)的炎性細胞因子的表達.pdf

1、機體免疫系統(tǒng)中，固有免疫在抵抗外來病原微生物感染中發(fā)揮重要的作用，固有免疫細胞通過模式識別受體(PRR)識別微生物結(jié)構(gòu)上高度保守的病原相關(guān)分子模式（PAMP），然后經(jīng)過一系列的信號級聯(lián)反應(yīng)來調(diào)控不同效應(yīng)分子的表達。其中TOLL樣受體(Toll-like Receptors，TLRs)作為重要的模式識別受體受到廣泛的關(guān)注，用相應(yīng)的配體如LPS，PGN等刺激固有免疫細胞后，TLRs細胞膜內(nèi)側(cè)TIR(Toll/IL-1 receptor ho

2、mologous region)結(jié)構(gòu)域募集MyD88，TRAF6，IKKβ等接頭分子，最終促進NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的活化，活化的轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)的反應(yīng)原件結(jié)合后，誘導(dǎo)大量的炎性細胞因子、趨化因子等的產(chǎn)生，從而促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生。其中TLR4(Toll-like Receptor 4)和TLR2(Toll-like Receptor 2)識別LPS和PGN后可以通過活化NF-κB的方式促進IL-6，TNF-α等細胞因子的表達，其產(chǎn)生的炎性細

3、胞因子在清除病原微生物感染中發(fā)揮重要的作用，但是TLRs的過度活化以及相應(yīng)炎性細胞因子的過度產(chǎn)生，將引發(fā)一系列與炎癥相關(guān)的疾病，尤其是自身免疫性疾病。因此，對促炎性細胞因子產(chǎn)生的機制研究顯得尤為重要。
　　 IκB激酶結(jié)合蛋白（IKK-interacting Protein, IKIP）是人類近期發(fā)現(xiàn)的一個新分子，經(jīng)過基因剪切后形成3個轉(zhuǎn)錄體，并翻譯成相應(yīng)的蛋白分子發(fā)揮功能。有報道稱，X射線照射能促進IKIP的表達，在內(nèi)皮細胞中

4、，p53可以調(diào)控IKIP的表達，在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要功能，作者通過酵母雙雜交的實驗發(fā)現(xiàn)IKIP可以與NF-κB上游的激酶IKKβ結(jié)合。由于IKKβ介導(dǎo)NF-κB活化的途徑在TLRs信號通路中同樣發(fā)揮著重要作用，因此IKIP是否參與TLRs信號通路，以及是否可以通過影響IKKβ進而調(diào)控NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)都有待進一步研究。
　　 研究目的:
　　 1、檢測LPS，PGN等TLRs配體刺激巨噬細胞后，IKIP的表達量

5、是否發(fā)生變化;
　　 2、探討IKIP是否影響LPS，PGN等TLRs配體誘導(dǎo)的促炎細胞因子的表達;
　　 3、探討IKIP調(diào)控TLRs信號通路中的NF-κB活化的分子機制。
　　 研究方法:
　　 1、 LPS，PGN刺激巨噬細胞，檢測IKIP的表達。
　　 C57/B6小鼠腹腔注射淀粉(6％)，72小時后，取出誘導(dǎo)產(chǎn)生的的原代腹腔巨噬細胞(Macrophage)，經(jīng)LPS，PGN刺激0、2、4

6、、8、12、24h，Trizol方法提取RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，最后用PCR方法檢測IKIP在mRNA水平的表達變化。
　　 同樣的方法取出巨噬細胞后，用LPS，PGN刺激相應(yīng)的時間點，然后收取蛋白，用western-blot的方法檢測IKIP蛋白水平的表達變化。
　　 2、檢測IKIP對促炎細胞因子的作用。
　　 2.1、轉(zhuǎn)染IKIP的siRNA后，western-blot方法檢測IKIP siRNA

7、的干擾效率
　　 將IKIP的干擾RNA(siRNA)及陰性對照干擾RNA(snRNA)轉(zhuǎn)染入人胚胎腎細胞系HEK293(Human Embryonic Kidney HEK293，HEK293)，靜置培養(yǎng)24h，再轉(zhuǎn)入Flag-IKIP表達載體，24h后收取蛋白，用BCA方法調(diào)整濃度一致，western-blot檢測IKIP蛋白水平的變化。
　　 2.2、轉(zhuǎn)染IKIP siRNA后，LPS、PGN刺激巨噬細胞，檢測促炎

8、性細胞因子的表達變化
　　 驗證IKIP相應(yīng)的siRNA干擾效率后，選取高干擾效率的siRNA，將其轉(zhuǎn)染入腹腔巨噬細胞，48h后，用LPS刺激巨噬細胞相應(yīng)時間點，提取RNA，進行反轉(zhuǎn)錄，利用PCR技術(shù)分析炎性細胞因子IL-6，TNF-α以及Ⅰ型干擾素mRNA水平上的表達變化。
　　 將Flag-IKIP表達載體轉(zhuǎn)染Hela細胞系，24小時后用LPS刺激相應(yīng)時間點，RT-PCR方法檢測促炎細胞因子IL-6，TNF-α和Ⅰ型

9、干擾素的表達變化。將Flag-IKIP表達載體轉(zhuǎn)染HEK293-TLR2細胞系，4小時后用PGN刺激相應(yīng)時間點，RT-PCR方法檢測促炎細胞因子IL-6，TNF-α和Ⅰ型干擾素的表達變化。
　　 3、IKIP對TLRs信號通路中NF-κB活化調(diào)控的分子機制研究。
　　 3.1、轉(zhuǎn)染Flag-IKIP表達載體和TLRs信號通路接頭分子表達載體以及NF-κB，IFN-β報告基因質(zhì)粒后，檢測NF-κB，IFN-β報告基因活性的

10、變化情況
　　 首先將Flag-IKIP表達載體和TLRs信號通路不同的接頭分子的表達載體以及NF-κ B，IFN-β報告基因質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入HEK293細胞，24小時后，收取細胞，用雙熒光素酶報告基因的方法檢測IKIP對NF-κB報告基因活性的影響以及對IFN-β報告基因活性的影響，分析IKIP影響NF-κB活性的可能靶點。
　　 3.2、干擾IKIP后，Western-blot檢測NF-κB及相關(guān)內(nèi)源性蛋白分子的磷酸化情

11、況
　　 將驗證好的siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細胞48h后，用LPS刺激巨噬細胞相應(yīng)時間點，收取蛋白，調(diào)整濃度一致后，western blot方法檢測NF-κB及相關(guān)內(nèi)源性蛋白分子的磷酸化情況，進一步確定IKIP對NF-κB通路的影響。
　　 3.3、驗證IKIP與IKKβ的結(jié)合
　　 將Flag-IKIP表達載體與HA-IKKβ表達載體共同轉(zhuǎn)入Hela細胞系或HEK293-TLR2細胞系后，分別用LPS或者PGN刺激2

12、h，收取蛋白，通過免疫共沉淀（Immunoprecipitation，IP）方法檢測兩個分子的結(jié)合情況。
　　 3.4、IKIP對IKK復(fù)合物形成的影響。
　　 首先將Flag-IKIP表達載體與HA-IKKβ，HA-IKKα，HA-IKKγ表達載體共同轉(zhuǎn)入Hela細胞系24小時后，再用LPS刺激相應(yīng)時間后，收取蛋白，通過免疫共沉淀的方法進一步明確IKIP與IKK復(fù)合物中IKKβ分子的結(jié)合情況。為進一步明確作用方式，通過

13、劑量競爭實驗，轉(zhuǎn)染不同劑量的MYC-IKIP表達載體和相同劑量的HA-IKKβ，HA-IKKγ表達載體于Hela細胞，24小時后用LPS刺激相應(yīng)時間點，收取蛋白，通過免疫共沉淀方法檢測隨著IKIP的劑量的增加，IKKβ與HA-IKKγ結(jié)合是否發(fā)生變化。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、LPS、PGN刺激巨噬細胞后，IKIP的表達量隨著刺激時間的增加發(fā)生明顯上調(diào)。
　　 C57/B6小鼠腹腔注射淀粉(6％)，72小時后

14、，取出誘導(dǎo)產(chǎn)生的的原代腹腔巨噬細胞(Macrophage)，經(jīng)LPS，PGN刺激0、2、4、8、12、24h，Trizol方法提取RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，最后用PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)，IKIP mRNA的表達隨著時間的增長而顯著增加。
　　 同樣的方法取出巨噬細胞后，用LPS，PGN刺激相應(yīng)的時間點，然后收取蛋白，用western-blot的方法檢測發(fā)現(xiàn)，隨著刺激時間的增加，IKIP蛋白水平的表達也明顯增加。結(jié)論:通過LP

15、S、PGN刺激巨噬細胞，IKIP的表達明顯上調(diào)
　　 2、IKIP抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生
　　 2.1、IKIP siRNA的干擾效果的驗證
　　 將IKIP相應(yīng)的干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染入HEK293細胞24h后，再轉(zhuǎn)入Flag-IKIP載體，24h后收取蛋白，用BCA方法調(diào)整濃度后，western-blot檢測IKIP蛋白。IKIPsiRNA可以顯著抑制FLAG-IKIP的表達。
　　 2.2、I

16、KIP抑制促炎細胞因子的分泌
　　 將驗證好的siRNA轉(zhuǎn)入原代腹腔巨噬細胞48小時后，再用LPS，PGN分別刺激4小時，8小時，收取細胞，提取RNA，進行反轉(zhuǎn)錄，后用PCR分析，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，干擾IKIP后，促炎因子IL-6，TNF-α的表達明顯上調(diào)。而IFN-β無明顯的變化。
　　 把Flag-IKIP載體分別轉(zhuǎn)入Hela和HEK293-TLR2細胞24小時后，LPS刺激Hela，PGN刺激HEK293-TLR2

17、細胞，提取RNA，進行反轉(zhuǎn)錄，用PCR方法，與對照組相比，檢測促炎性細胞因子IL-6，TNF-α的表達明顯下調(diào)。而IFN-β的表達無明顯的變化。
　　 3、IKIP抑制NF-κB活性。
　　 3.1、IKIP抑制NF-κB報告基因的活性
　　 將Flag-IKIP，TLRs信號通路不同的接頭分子以及NF-κB報告質(zhì)粒，IFN-β報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，24小時后，收取細胞，通過雙熒光素酶報告基因的方法檢

18、測，與對照組相比，IKIP實驗組可顯著降低MyD88、IKK-β所誘導(dǎo)的NF-κB報告質(zhì)粒的熒光素酶活性。對TRIF，MyD88所介導(dǎo)的IFN-β報告質(zhì)粒的熒光素酶活性沒有影響，進一步說明IKIP可NF-κB的活化。
　　 3.2、Western-blot檢測IKIP對NF-κB相關(guān)的內(nèi)源性蛋白的影響
　　 將驗證好的siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細胞48h后，LPS分別刺激巨噬細胞30分鐘，60分鐘，收取蛋白，用BCA的方法調(diào)整蛋

19、白濃度，western blot檢測pIκB，pP65，IκBα，P65的變化，與對照組相比，發(fā)現(xiàn)干擾IKIP后，pIκB，pP65蛋白水平明顯上調(diào);I-κBα降解增加，進一步說明IKIP對NF-κB的活化起到抑制作用。
　　 4、IKIP通過抑制IKKγ結(jié)合IKKβ負向調(diào)控NF-κB活化
　　 4.1、IKIP結(jié)合IKKβ
　　 將Flag-IKIP與HA-IKKβ載體共同分別轉(zhuǎn)入Hela細胞，HEK293-T

20、LR2細胞24h后，再用LPS刺激2h，收取蛋白，免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，IP)的方法，檢測到Flag-IKIP與HA-IKKβ兩個分子的結(jié)合。結(jié)果表明，LPS刺激后可以誘導(dǎo)IKIP結(jié)合IKKβ。
　　 4.2、IKIP通過與IKKγ競爭的方式結(jié)合IKKβ負向調(diào)控NF-κB活化
　　 將Flag-IKIP與HA-IKKβ，HA-IKKα，HA-IKKγ載體共同轉(zhuǎn)入Hela細

21、胞24小時后，再用LPS刺激2h，收取蛋白，通過免疫共沉淀的方法進一步檢測到IKIP僅僅與IKK復(fù)合物中IKKβ結(jié)合，而不是與其復(fù)合物的結(jié)合。為進一步明確結(jié)合IKKβ，IKIP的作用方式，我們又采取劑量競爭實驗，轉(zhuǎn)染不同劑量的MYC-IKIP和相同劑量的HA-IKKβ，HA-IKKγ于Hela細胞，LPS刺激2小時后，收取蛋白，IP的方法檢測到隨著IKIP劑量的增加，與IKKβ結(jié)合的IKKγ的量減少，表明，IKIP通過與IKKγ競爭結(jié)合

22、IKKβ，影響IKK復(fù)合物的活性，來發(fā)揮抑制作用的。
　　 結(jié)論:
　　 1、LPS、PGN可以誘導(dǎo)巨噬細胞中IKIP的表達量。
　　 2、IKIP抑制LPS、PGN誘導(dǎo)的促炎因子及Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。
　　 3、IKIP負向調(diào)節(jié)NF-κB信號通路。
　　 4、IKIP通過與IKKγ競爭結(jié)合IKKβ，影響IKK復(fù)合物的形成，負向調(diào)控NF-κB的活性，發(fā)揮抑制炎癥過度反應(yīng)的作用。
　　 創(chuàng)新點