dsODNs靶向封閉肺泡巨噬細胞NF-κB信號通路的抗炎作用機制研究.pdf

1、目的：評估脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的雙鏈寡聚脫氧核苷酸（dsODNs）競爭性抑制對肺泡巨噬細胞（AMs）中核因子-κB（NF-κB）與DNA結合活性的影響效能，確定脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染dsODNs的最適濃度及最佳轉(zhuǎn)染時間，驗證dsODNs-decoy策略靶向封閉肺泡巨噬細胞中NF-κB信號通路的可行性，并探討其抗炎作用機制。
　　方法：在動物實驗中取出家兔的支氣管肺組織，用溫生理鹽水灌洗提取肺泡巨噬細胞，經(jīng)提純鑒定后，分對照組、LPS刺激組、Lipofe

2、ctamine2000組和不同比例dsODNs-Lipofectamine2000組，分別給予不同處理后培養(yǎng)。各組在培養(yǎng)4 h、6 h、8 h三個時間點，用LDH試劑盒檢測各組細胞培養(yǎng)上清液中LDH含量，了解不同處理對 AMs的毒性損害；用共聚焦激光顯微鏡觀察不同時間點及不同比例dsODNs-Lipofectamine2000組AMs中熒光分布情況；用流式細胞儀檢測不同比例dsODNs-Lipofectamine2000組中AMs的熒光

3、強度及細胞攝取率確定最佳轉(zhuǎn)染條件；RT-PCR檢測dsODNs轉(zhuǎn)染后AMs中IL-1β、IL-6、TNF-α因子的 mRNA表達；Western-blot檢測dsODNs-Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染后AMs內(nèi)NF-κB p65亞基在細胞質(zhì)及細胞核中的分布情況。
　　結果：轉(zhuǎn)染AMs的dsODNs-Lipofectamine2000濃度比為1:5時，LDH檢測細胞毒性適中，轉(zhuǎn)染效率最佳；從熒光強度、細胞狀態(tài)及轉(zhuǎn)染效率等方

4、面綜合分析，轉(zhuǎn)染6 h為最佳時間；與LPS組比較，dsODNs-Lipofectamine2000組中IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥介質(zhì)的mRNA表達均明顯被抑制，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05)；Western-blot結果顯示，經(jīng)dsODNs-Lipofectamine2000處理后，AMs細胞質(zhì)中NF-κB p65亞基的表達明顯多于細胞核中。
　　結論：dsODNs-Lipofecetamine2000能在體外有效轉(zhuǎn)