紫草素在口腔鱗癌NF-κB信號通路中作用機制的研究.pdf

1、抗腫瘤治療一直是臨床上的一大難題，手術治療對早中期的實體瘤效果較好，但對晚期患者療效相對較差；放化療雖然有效，但毒副作用較大；基因治療前景很廣，但是離臨床實際應用還有較長的距離；低毒高效的天然植物成分已經(jīng)成為抗腫瘤治療的新希望，當今抗腫瘤藥物發(fā)展戰(zhàn)略之一即是從天然產物中尋找活性成分，特別是與現(xiàn)代分子生物學的進展結合起來，期望進一步提高腫瘤治療效果。 口腔鱗狀細胞癌是一種侵襲性較強的頭頸部上皮來源惡性腫瘤，近年來，在我國有發(fā)病率上

2、升且發(fā)病年齡年輕化的趨勢。盡管包括手術，放療以及化療在內的各種治療手段都在不斷的改進，口腔鱗癌患者的五年生存率仍徘徊在60％上下，晚期患者則僅為20～40％，術后造成的功能障礙和容貌破壞，亦給患者帶來了極大的心理負擔和生活障礙。因此，從天然植物中研究開發(fā)具有靶向性的低毒有效化學藥物，并最終應用于臨床以提高口腔鱗癌尤其是晚期患者的生存率和生存質量極為重要。 近年來大量研究表明：由天然植物紫草中提取出的小分子化合物紫草素可以從多個層

3、面上抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，相對于目前臨床應用的化學制劑，其對人體的毒副作用較小，可能成為一種新型的低毒高效抗腫瘤藥物，具有良好的發(fā)展應用前景。本研究擬通過實驗觀察，探討紫草素靶向治療口腔鱗癌的可行性及相關分子機制，為口腔鱗癌的有效防治探索新的途徑。 目的：觀察紫草素在體外對口腔鱗癌Tca-8113細胞系增殖，凋亡以及轉移侵襲等生物學行為的影響，重點研究NF-κB信號通路及其下游調控分子Bcl家族和Caspase家族在紫草素抗口腔

4、鱗癌過程中的參與機制，為今后的紫草素相關衍生物的合成改進及臨床應用提供實驗依據(jù)。 方法：1.以口腔鱗癌Tca-8113細胞為研究對象，正常口腔粘膜細胞作為對照，采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法觀察紫草素對癌細胞的體外增殖抑制作用；采用光鏡和透射電鏡觀察細胞形態(tài)結構的變化；采用流式細胞儀分析細胞周期；采用DNAladder及流式細胞AnnenxinV/PI染色檢測細胞凋亡情況。2.通過細胞運動遷移實驗、細胞粘附實驗和Transwel

5、l侵襲實驗觀察紫草素對Tca-8113細胞的體外黏附，運動及侵襲能力的影響，進一步通過免疫細胞化學和酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測紫草素對Tca-8113細胞MMP-2,9分泌和E-cadherin,CD44v6蛋白表達的影響。3.采用蛋白印跡法(Westernblot)檢測IκBa，磷酸化-IκBa蛋白的表達，采用免疫細胞化學法檢測p65蛋白的定位及表達，采用凝膠遷移滯后實驗(EMSA)檢測NF-κB的DNA結合活性。4.采用蛋白印跡法(Wes

6、ternblot)檢測Bcl-2及Bax蛋白的表達，采用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)分析紫草素及泛Caspase抑制劑作用前后Caspase3，8，9的活性。 結果：1.MTT結果顯示，在10～50umol/L濃度范圍內，紫草素對Tca-8113細胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)明顯的時間和濃度依賴性，電鏡下可見典型的細胞核皺縮及凋亡小體，DNA瓊脂糖凝膠電泳觀察到典型梯狀條帶，流式細胞儀定量分析結果顯示亞G1期細胞明顯增加，各實驗組細胞

7、凋亡率均明顯高于對照組。2.細胞運動遷移實驗、粘附實驗和Transwell侵襲實驗顯示紫草素對Tca-8113細胞的的體外黏附、運動及侵襲能力沒有顯著影響；免疫細胞化學和酶聯(lián)免疫吸附實驗表明紫草素作用后Tca-8113細胞MMP-2,9的分泌無明顯變化；E-cadherin蛋白的表達雖有增高趨勢，但與對照組相比未達到統(tǒng)計學上的差異。3.Westernblot和免疫細胞化學的結果顯示，紫草素處理后的口腔鱗癌Tca-8113細胞內IκBa蛋

8、白和p65蛋白無明顯變化，但磷酸化-IκBa蛋白的表達水平卻明顯降低；EMSA結果顯示紫草素作用后，NF-κB的DNA結合活性受到明顯抑制。4.紫草素作用后，Tca-8113細胞內Bcl-2蛋白的表達顯著減少，Caspase-3，-8,-9在紫草素誘導的細胞凋亡過程中被激活，泛Caspase阻斷劑Z-Asp-CH2-DCB則可以明顯抑制紫草素引起的細胞增殖抑制及凋亡。 結論：1.紫草素對口腔鱗癌細胞系Tca-8113具有明顯的增

9、殖抑制及凋亡誘導作用，可用于口腔鱗癌化學防治的新嘗試。2.紫草素對口腔鱗癌Tca-8113細胞系的體外黏附能力、運動遷移能力及侵襲能力均無明顯抑制作用，對基質金屬蛋白酶MMP-2,9的分泌也無明顯影響，但可以輕微的上調E-cad蛋白的表達，有通過化學改型而達到抑制腫瘤細胞侵襲轉移的潛力。3.紫草素的誘導口腔鱗癌細胞凋亡作用至少部分通過抑制NF-κB信號通路活性來實現(xiàn)，應用紫草素特異性的抑制口腔鱗癌中高激活狀態(tài)的NF-κB通路可成為口腔鱗