Profilin2及其信號(hào)通路在口腔鱗癌中的作用研究.pdf

1、目的:課題前期應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法,通過構(gòu)建口腔黏膜上皮細(xì)胞癌變模型,已篩選出了45個(gè)口腔鱗癌細(xì)胞系與口腔永生化正常上皮細(xì)胞系之間的潛在差異蛋白質(zhì)。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)驗(yàn)證了部分癌或抑癌基因?qū)谇击[癌細(xì)胞生長(zhǎng),增殖及轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用。此實(shí)驗(yàn)旨在通過進(jìn)一步篩選驗(yàn)證Profilin2在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展中的作用,并探討該家族蛋白及其相關(guān)信號(hào)通路蛋白的抑癌作用機(jī)制。
　　方法:1.通過分析口腔鱗癌質(zhì)譜芯片分析結(jié)果,篩選出Profili

2、n2基因,并通過RT-PCR,Realtime-PCR,Western blotting實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證該基因:在正?？谇徽衬び郎掀ぜ?xì)胞系及多個(gè)不同口腔鱗癌細(xì)胞系,口腔正常上皮組織,口腔鱗癌組織中的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平的差異。
　　2.收集88個(gè)原發(fā)口腔鱗癌患者的鱗癌組織及癌旁正常蠟塊(成對(duì)),通過分析所有患者的預(yù)后相關(guān)信息進(jìn)行分組,進(jìn)而驗(yàn)證Profilin2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異對(duì)口腔鱗癌患者預(yù)后水平的潛在影響。
　　3.通過P

3、rofilin2的蛋白熒光染色,并同時(shí)應(yīng)用激光共聚焦的定位方法,明確Profilin2在永生化口腔黏膜正常上皮細(xì)胞及口腔鱗癌細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。利用細(xì)胞質(zhì)核蛋白分離技術(shù),進(jìn)一步驗(yàn)證其細(xì)胞定位及差異表達(dá)。
　　4.通過質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染profilin2基因過表達(dá)技術(shù),上調(diào):Profilin2基因的蛋白質(zhì)表達(dá),并研究Profilin2對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖及調(diào)亡,細(xì)胞活力的影響。
　　5.通過Realtime PCR,Western b

4、lotting的方法,初步驗(yàn)證相關(guān)信號(hào)通路P27/Cyclin D/CDK與N-WASP/Arp2/3在Profilin2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的表達(dá)差異,并推測(cè)其作用機(jī)制。
　　結(jié)果:1.通過二維電泳液相質(zhì)譜分析,從口腔鱗癌細(xì)胞系中篩選出了Profilin1及Profilin2的差異表達(dá)蛋白質(zhì),通過Hb96,Tca8113,OSC,CAL27,NT等5個(gè)不同口腔鱗癌細(xì)胞系與永生化正常口腔黏膜上皮細(xì)胞系HIOEC比較,并選取32個(gè)口腔鱗癌患者

5、的RNA標(biāo)本,在mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平上驗(yàn)證了Profilin2表達(dá)下調(diào)的芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　2.免疫組化及Realtime-PCR的結(jié)果顯示:在收集的88對(duì)口腔鱗癌組織內(nèi),Profilin2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均有較明顯下降。將該組患者依照腫瘤部位、大小、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、病理分級(jí)等情況進(jìn)行分組,統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)Profilin2的表達(dá)水平與患者總體生存率顯著相關(guān)(P＜0.001)。
　　

6、3.通過激光共聚焦顯微鏡的熒光成像方法及核質(zhì)分離技術(shù),顯示Profilin2在口腔鱗癌細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位:細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)。
　　4.通過構(gòu)建pQCXIH-Profilin2質(zhì)粒,并進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、上調(diào)Profilin2基因在口腔鱗癌細(xì)胞系HB96中的表達(dá)。觀察該基因上調(diào)后,HB96癌細(xì)胞出現(xiàn)增殖減緩,細(xì)胞活力下降的變化。
　　5.通過轉(zhuǎn)染pQCXIH-Profilin2質(zhì)粒,觀察72小時(shí)后Profiilin2相關(guān)蛋白的RNA轉(zhuǎn)

7、錄,蛋白表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)Profilin2對(duì)P27的表達(dá)無明顯調(diào)控作用,但對(duì)N-WASP/Arp2/3通路的表達(dá)有一定相關(guān)性。
　　結(jié)論:1.Profilin2在口腔鱗癌細(xì)胞系及患者組織中均有較明顯下調(diào),而Profilin1在口腔鱗癌與正?？谇徽衬ど掀そM織中表達(dá)基本均為高表達(dá)。
　　2.Profilin2基因在口腔粘膜上皮內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)物主要位于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)內(nèi);但在口腔鱗癌細(xì)胞中,Profilin2的亞細(xì)胞定位發(fā)生改變,主要位于

8、細(xì)胞核內(nèi)。此結(jié)果意味著Profilin2在鱗癌細(xì)胞中的作用方式可能有相應(yīng)的改變。
　　3.Profilin2的表達(dá)下調(diào),與許多口腔鱗癌患者的總體生存率密切相關(guān),Profilin2可能是一個(gè)重要的口腔鱗癌生物預(yù)后指標(biāo)。
　　4.通過升高Profilin2的表達(dá),抑制了HB96鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng),并使鱗癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)活力下降,證明Profilin2是一個(gè)抑癌基因,是一個(gè)潛在的藥物靶點(diǎn)。
　　5.Profilin2對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞的