RhoA信號通路在CCR7調(diào)控的頭頸鱗癌侵襲和生存中作用的研究.pdf

1、目的：
　　因此本研究希望通過組織實驗檢測趨化因子受體CCR7及RhoA在頭頸鱗癌中的表達及其與臨床病理特性的相關(guān)性，體外實驗觀察趨化因子CCL19及其受體CCR7通過RhoA及下游信號通路對人頭頸鱗癌PCI-37B細胞趨化、侵襲及生存能力的影響，探討CCR7-RhoA作用的分子機制，研究結(jié)果將進一步豐富頭頸鱗癌中CCR7下游信號網(wǎng)絡(luò)圖譜，為針對CCR7-RhoA的頭頸鱗癌生存與轉(zhuǎn)移的靶向干預(yù)提供理論基礎(chǔ)與實驗依據(jù)。
　　方

2、法：
　　75例頭頸鱗癌組織標本和10例正常口腔粘膜標本。患者術(shù)前均未接受過任何化學(xué)或放射治療。福爾馬林固定石蠟包埋的腫瘤組織切片常規(guī)進行HE染色，分別由兩名病理醫(yī)師診斷，根據(jù)TNM分期系統(tǒng)(2002)，進行臨床病理分期。75例SCCHN中包括:男42例，女33例，＞60歲39例，≤60歲36例;腫瘤大小:T1,T2∶34例，T3，T4∶41例;臨床病理分期Ⅰ-Ⅱ期32例，Ⅲ-Ⅳ期43例;伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例。<

3、br>　　免疫組化染色:SP法檢測頭頸鱗癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶和無轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及癌旁正常組織的RhoA及CCR7蛋白表達情況。組織切片常規(guī)脫蠟并水化。染色步驟簡述如下:0.1mol/L Tris-HCI(pH10.0)緩沖液，高溫高壓修復(fù)抗原2.5min;3％H2O2和5％山羊血清37℃下分別孵育切片1h;一抗（1∶200稀釋）4℃孵育過夜，二抗和SP復(fù)合物37℃分別孵育切片30min;最后DAB顯色

4、，蘇木素復(fù)染細胞核。兩名病理診斷醫(yī)師分別對組織切片染色情況進行評分。胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒視為陽性細胞。至少5個高倍視野下(400×)評價RhoA與CCR7染色細胞百分比:細胞無染色或染色＜10％=（-），11-50％=(+)，51-75％=(++),＞76％=(+++)。
　　細胞系:人CCR7高表達頭頸部鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細胞系PCI-37B（由匹茲堡大學(xué)腫瘤研究所惠贈）。
　　RhoA親和沉淀反應(yīng):
　　細胞進行相應(yīng)處理

5、后，于冰上操作，小心棄去細胞培養(yǎng)液，加入試劑盒中的裂解液，用細胞刮刀將細胞刮下，并收集到離心管中，短暫的渦旋振蕩處理后，置于冰上靜置5分鐘，之后將離心管于4℃，16000g，離心15分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，置于冰上;用BCA法測定上面得到的細胞裂解液上清的蛋白濃度。
　　將試劑盒中的谷胱甘肽樹脂充分搖勻，使樹脂呈完全懸浮狀態(tài)，按照每個樣品取出100ul樹脂懸液，并分別加入離心濾柱中，6000g離心30秒，去除樹脂中的懸液

6、，然后每個管中加入400ul的結(jié)合緩沖液，輕柔混勻，繼續(xù)于6000g離心30秒，以對樹脂進行平衡;加入400ug的GST-Rhotekin-RBD及700ul的細胞裂解液上清液，將含有樹脂、GST-Rhotekin-RBD及細胞裂解上清液的溶液混勻，至于4℃反應(yīng)1h，之后6000g離心30秒，去除與樹脂混合的液體，并加入漂洗液，繼續(xù)離心漂洗樹脂兩次，將離心后的含樹脂的離心柱放入新的收集管中，加入變性緩沖液，渦旋振蕩2分鐘，6000g離心

7、2分鐘，收集離心得到的變性緩沖液，將收集后的緩沖液與100℃水浴加熱2分鐘，之后的樣本便可用RhoA的抗體進行Westem blot檢測。
　　使用各抑制劑預(yù)處理細胞，然后CCL19誘導(dǎo)，Transwell小室檢測細胞的遷移和侵襲能力的變化。
　　趨化實驗:采用Transwell趨化小室法檢測。將加入不同處理因素的細胞消化離心后計數(shù)，在趨化小室的下室加600μl低糖DMEM，內(nèi)含0.5％BSA及200ng/mlCCL19，將

8、1×106/ml細胞接種于趨化小室的上室200μ.l，以無CCL19刺激的正常細胞為空白對照組，每組3個復(fù)孔。24小時后結(jié)晶紫染色，隨機選取5個高倍視野計數(shù)遷移細胞數(shù)。實驗重復(fù)三次，取平均值。
　　侵襲實驗:在趨化小室的多聚碳酸脂膜上預(yù)先鋪入1:8稀釋的Matrigel基質(zhì)膠，4℃風(fēng)干。趨化小室在孵育箱中作用時間延長至36小時。其他步驟同趨化實驗。
　　劃痕實驗:將細胞接種于24孔板中，待其生長至80％時，將細胞饑餓12小時

9、進行同步化，用100μl槍頭進行劃痕后用無血清DMEM沖洗2遍，分別加入各種處理因素，以無血清的DMEM為空白對照組，24h照相觀察劃痕的相對寬度。0h設(shè)定為100％。
　　Western blot實驗:對數(shù)生長期的細胞饑餓24小時，細胞進行分組處理后，采用含有PMSF和磷酸酶抑制劑混合物的M-PER(PIERCE)蛋白提取試劑提取細胞蛋白?？捡R斯亮藍法檢測蛋白濃度，上樣總蛋白為80μg。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5

10、％BSA封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗IgG37℃孵育2小時，最后酶顯法，顯色劑顯色。ImageJ軟件用于半定量分析特異性條帶的光密度值，將目的蛋白與β-actin光密度比值作為相對表達量。實驗至少重復(fù)3次，取平均值。CCK-8法檢測不同分組處理細胞的增殖能力，PI單染檢測細胞周期變化，AV/PI雙染流式細胞術(shù)、Hoechst染色聯(lián)合激光共聚焦顯微鏡檢測細胞凋亡變化。統(tǒng)計學(xué)分析:SPSS13.0統(tǒng)計軟件用于數(shù)據(jù)分析處理。RhoA，CCR7

11、表達與臨床病理因素的關(guān)系用x2檢驗，RhoA與CCR7相關(guān)性用Spearman檢驗，p＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。其他實驗采用t檢驗，結(jié)果用mean士sd表示，p＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、RhoA、CCR7在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的頭頸鱗癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶高表達
　　RhoA和CCR7主要表達于腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細胞的細胞質(zhì)及細胞膜。在頭頸鱗癌組織中高表達，在正常的口腔黏膜和非轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)低表達或無表達。統(tǒng)計分析結(jié)果

12、顯示:RhoA表達與頭頸鱗癌的臨床病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與患者的年齡、分化程度、腫瘤大小無關(guān)。CCR7和RhoA在頭頸鱗癌中表達存在相關(guān)性。
　　2、頭頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細胞PCI-37B中 CCR7激活可以引起RhoA活化
　　應(yīng)用CCL19處理細胞30分鐘后用免疫沉淀實驗檢測活化RhoA及總蛋白表達量。實驗結(jié)果顯示各處理條件下，內(nèi)源性蛋白的表達無明顯變化。CCL19刺激PCI-37B細胞后，活性RhoA的表達量為

13、空白對照組的1.5倍，與空白組比較，具有顯著性差異(p＜0.05)。而C3預(yù)處理組再經(jīng)CCL19刺激，活性RhoA表達量僅為空白對照組的1/3，與CCL19組比較，同樣具有顯著性差異(p＜0.05)。而CCR7mAb處理組的表達水平與空白對照接近，與CCL19組比較，也具有顯著性差異(p＜0.05)。提示CCL19可以使RhoA活化，而這種效應(yīng)可以被C3阻斷。
　　3、RhoA的活化與CCL19誘導(dǎo)的頭頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細胞PCI-

14、37B的趨化和侵襲能力相關(guān)
　　應(yīng)用RhoA抑制劑C3 exoenzyme和CCL19對PCI-37B細胞進行處理后，通過遷移，趨化和侵襲實驗，檢測細胞的趨化和侵襲能力。結(jié)果顯示:200ng/ml的CCL19和50ng/mlC3是最佳的作用濃度，與空白對照組相比CCL19誘導(dǎo)增強細胞的趨化及侵襲能力1.5倍左右，兩組相比具有顯著性差異(p＜0.05)。而CCR7mAb預(yù)處理的細胞遷移及侵襲能力接近空白對照組，與CCL19處理組相比

15、，差異同樣有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。RhoA抑制劑C3預(yù)處理細胞的遷移及侵襲能力顯著下降，僅為空白對照組的1/2，與CCL19處理組相比，具有顯著性差異(p＜0.05)。
　　4、CCR7通過RhoA調(diào)控頭頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細胞PCI-37B細胞的Pyk2和cofilin的活化，對MLC無影響
　　Western blot結(jié)果顯示:細胞經(jīng)CCL19刺激后p-Pyk2的表達量明顯增加而p-cofilin的表達明顯受到抑制。C

16、3和Y-27632預(yù)處理的細胞，p-Pyk2表達量降低而p-cofilin表達量升高，即RhoA抑制劑明顯抑制Pyk2和cofilin的活化，即使p-cofilin表達上調(diào)，而p-Pyk2表達下調(diào)，與CCL19組相比，具有顯著性差異(p＜0.05)。而p-MLC的表達量在各組細胞中變化無顯著差異。
　　5、CCR7通過RhoA調(diào)控頭頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細胞PCI-37B細胞的增殖和凋亡
　　CCK-8實驗結(jié)果表明，CCL19提高

17、細胞的增殖能力，而C3預(yù)處理雖再經(jīng)CCL19刺激，細胞增殖能力顯著下降，兩組相比有顯著性差異(p＜0.05)。同時，AV/PI染色法檢測結(jié)果表明，C3預(yù)處理組早期凋亡和死亡的細胞數(shù)量明顯增加，與CCL19處理組相比有顯著性差異(p＜0.05)。Hoechst染色結(jié)果顯示與CCL19處理組相比，C3處理組和聯(lián)合作用組出現(xiàn)濃染致密的顆粒狀或塊狀熒光。
　　結(jié)論：
　　1、頭頸鱗癌中，CCR7能夠激活RhoA信號通路。