梅毒螺旋體粘附蛋白Tp0155、Tp0483通過(guò)激活NF-κB誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子.pdf

1、目的:探討梅毒螺旋體(Treponemapallidum, Tp)重組粘附蛋白Tp0155和Tp0483潛在的誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞(Mφ)產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的能力;探討Tp0155和Tp0483誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6、IL-1β和TNF-α是否與NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。
　　方法:通過(guò) Genbank獲取所選 Tp0155和Tp0483蛋白的基因序列,以 Tp Nichols株全基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增目

2、的片段,將其亞克隆至原核表達(dá)載體pET28a(+)中構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)/Tp0155和pET28a(+)/Tp0483,經(jīng)PCR、雙酶切、測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coliRosseta中,IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。采用SDS-PAGE和Western blot分析和鑒定表達(dá)產(chǎn)物;Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度;Detoxi-Gel?內(nèi)毒素去除膠去除重組蛋白中的內(nèi)毒素。用佛波酯(PMA)誘導(dǎo)THP-

3、1細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Mφ,并用Tp0155和Tp0483重組蛋白刺激Mφ,采用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)Mφ分泌炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平;提取Tp0155和Tp0483處理后的Mφ的總蛋白, Western blot檢測(cè)Mφ總蛋白中κB抑制蛋白(IκB)的降解情況。用NF-κB特異性抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)預(yù)處理 Mφ30 min,再以 Tp0155和Tp0483重組蛋白刺激Mφ,分析其對(duì)IL-6、IL-

4、1β和TNF-α產(chǎn)生的影響。
　　結(jié)果: PCR成功擴(kuò)增Tp0155和Tp0483出基因目的片段,重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定證實(shí)與Genbank上登錄序列完全一致;在IPTG誘導(dǎo)下,重組表達(dá)菌分別表達(dá)了一相對(duì)分子量約為46kDa(Tp0155)和47kDa(Tp0483)的重組蛋白,目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)以可溶性和包涵體形式存在,包涵體蛋白為主要存在形式,經(jīng)Ni-NTA親和純化后,純度在95％以上;內(nèi)毒素去除膠處理重組蛋白后,鱟實(shí)驗(yàn)檢

5、測(cè)內(nèi)毒素含量小于0.04EU/mL;0.5~5μg/mL Tp0155和0.5~7μg/mL Tp0483重組蛋白均能通過(guò)劑量依賴方式誘導(dǎo)PMA轉(zhuǎn)化后的Mφ產(chǎn)生IL-6、IL-1β和TNF-α炎癥因子的產(chǎn)量都隨著蛋白濃度的增加而增加,到達(dá)某個(gè)最高值后逐步減少。Tp0155的濃度在5μg/mL時(shí),TNF-α的量達(dá)到高峰,為(963.85〒29.66) pg/mL, Tp0155的濃度在7μg/mL時(shí),IL-1β和IL-6的量達(dá)到高峰;Tp

6、0483的濃度在5μg/mL時(shí),TNF-α、IL-1β和IL-6的量同時(shí)達(dá)到高峰。且分泌水平呈一定的時(shí)間依賴性:炎癥因子的產(chǎn)量隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加,分別在不同時(shí)間達(dá)到最高值,TNF-α在刺激24h后達(dá)到高峰,而IL-6和IL-1β為48h后達(dá)到高峰。Western blot結(jié)果顯示,Tp0155和Tp0483均能誘導(dǎo)Mφ內(nèi)IκB降解;經(jīng)PDTC處理后, Tp0155和Tp0483分別能使Mφ的IL-6產(chǎn)生量降至53%和49%;IL-1β產(chǎn)