解脲脲原體LAMPs通過激活NF-κB誘導小鼠巨噬細胞表達iNOS和凋亡.pdf

1、目的:研究從解脲脲原體(Uu)提取的脂質相關膜蛋白(LAMPs)在體外誘導小鼠巨噬細胞表達誘導性一氧化氮合酶(iNOS)及產(chǎn)生一氧化氮(NO)的水平，研究該膜蛋白能否激活小鼠巨噬細胞中核因子kappaB(NF-κB)及誘導細胞發(fā)生凋亡的情況，以便了解Uu潛在的致病性，為進一步探討UuLAMPs誘導小鼠巨噬細胞表達iNOS及誘導巨噬細胞發(fā)生凋亡的分子機制提供實驗依據(jù)。方法:用從Uu提取的LAMPs刺激小鼠巨噬細胞，用Griess試劑測定經(jīng)

2、刺激后的小鼠巨噬細胞產(chǎn)生的NO水平，以RT-PCR和Westernblot方法分析iNOS的表達水平，用細胞免疫組化、間接免疫熒光檢測NF-κB的激活，用Westernblot檢測核提取物中NF-κB蛋白的表達，且利用RT-PCR和Westernblot方法檢測NF-κB的特異性抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)和蛋白酶抑制劑放線菌酮(CHX)對iNOS的表達及對NF-κB激活的影響。用細胞凋亡檢測試劑盒檢測經(jīng)UuLAMPs處理的小

3、鼠巨噬細胞的凋亡情況。結果:UuLAMPs能誘導小鼠巨噬細胞表達iNOS，且能以時間和劑量依賴方式刺激小鼠巨噬細胞產(chǎn)生NO，當LAMPs的濃度為3μg/mL時產(chǎn)生的NO量最多，為13.56±0.54μmol/L；但當LAMPs從3μg/mL增加到5μg/mL時，NO產(chǎn)生的量反而減少。另外當LAMPs刺激細胞4h后即可從培養(yǎng)基中檢測到NO，而刺激32h后產(chǎn)生的NO量則達到高峰。在用該膜蛋白與NF-κB的抑制劑PDTC或蛋白酶抑制劑放線菌酮

4、(CHX)共同處理巨噬細胞后，iNOS表達水平及所產(chǎn)生的NO能被部分抑制(P＜0.01)。UuLAMPs處理小鼠巨噬細胞2h后，其細胞漿內的NF-κB即被激活，使其從細胞漿中轉位到細胞核內；另外，UuLAMPs刺激小鼠巨噬細胞8h后，即可誘導巨噬細胞發(fā)生早期凋亡，16h后誘導巨噬細胞發(fā)生晚期凋亡而PDTC能抑制LAMPs誘導的小鼠巨噬細胞發(fā)生凋亡。結論:1.UuLAMPs能誘導小鼠巨噬細胞表達iNOS和產(chǎn)生NO；2.UuLAMPs能誘導