解脲脲原體對(duì)紅霉素耐藥機(jī)制的初步研究.pdf

1、支原體(Mycoplasma)是一類介于病毒和細(xì)菌之間能在細(xì)胞外繁殖的最小的原核生物，解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum，Uu)為支原體科、脲原體屬中主要微生物之一，是一類缺乏細(xì)胞壁、需甾醇并可分解尿素的兼性厭氧微生物，可分為2個(gè)群(Parvo生物群和T960生物群)共14個(gè)血清型。Uu?？稍谀行院团悦谀蛏车乐袡z出，既往研究表明，其與非淋菌性尿道炎(Nongonococcal urethritis，NGU)、黏

2、液膿性宮頸炎(Mucopurμlent cervicitis,MPC)、慢性前列腺炎、附睪炎、不孕不育等多種泌尿生殖道疾病高度相關(guān)。由于無細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，Uu對(duì)作用于細(xì)胞壁合成的抗菌藥物天然耐藥，而對(duì)干擾蛋白質(zhì)合成及DNA復(fù)制的藥物敏感。Uu對(duì)青霉素類、β-內(nèi)酰胺類、萬古霉素等完全不敏感，對(duì)多粘菌素、利福平、磺胺類藥物普遍耐藥，對(duì)支原體最有抑制活性的抗菌藥物是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及喹諾酮類。大環(huán)內(nèi)酯類抗菌素是治療Uu感染一線藥物之一，在妊娠

3、和兒童感染中，大環(huán)內(nèi)酯類抗菌素是治療Uu感染唯一推薦使用的藥物。近來國(guó)內(nèi)外研究表明，Uu對(duì)上述三類抗菌藥物的已有較高耐藥，尤以大環(huán)內(nèi)酯類耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻。目前，Uu對(duì)四環(huán)素類、喹諾酮類抗菌藥物的耐藥機(jī)制已基本明確，并已發(fā)展出相應(yīng)的檢測(cè)方法，而Uu對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌素的耐藥機(jī)制國(guó)內(nèi)外至今仍未有深入的研究。 對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的細(xì)菌中，其耐藥機(jī)制主要有大環(huán)內(nèi)酯類作用靶位點(diǎn)改變、藥物主動(dòng)外排、抗菌素滅活酶的產(chǎn)生三種，23sRNA V區(qū)2063

4、、2064位點(diǎn)突變是引起肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥豐要機(jī)制，人型支原體對(duì)紅霉素、阿奇霉素天然耐藥，主要為23SrRNA 2611位天然突變，其他對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的機(jī)制還有23SrRNA的2586、2576、和2056位點(diǎn)的突變，可能存在藥物外排系統(tǒng)。 本研究通過PCR測(cè)序方法檢測(cè)Uu紅霉素耐藥菌株23SrRNA的V區(qū)上熱點(diǎn)突變，并應(yīng)用特異性PCR方法檢測(cè)甲基化酶、多種外排泵等可能的耐藥基因，首次應(yīng)用分子牛物學(xué)方法探索Uu

5、對(duì)紅霉素耐藥的主要分子機(jī)制：并對(duì)Uu菌株進(jìn)行分群研究，探討Uu兩群之間對(duì)紅霉素的耐藥機(jī)制之間差異，以發(fā)現(xiàn)耐藥機(jī)制的規(guī)律，并進(jìn)一步探討臨床耐藥菌株耐藥機(jī)制監(jiān)測(cè)方法，對(duì)指導(dǎo)臨床用藥、監(jiān)測(cè)及控制耐藥形勢(shì)的發(fā)展均有重要意義。 方法： 1.收集臨床菌株73株及1～14型血清型Uu標(biāo)準(zhǔn)菌株，進(jìn)行培養(yǎng)鑒定及分子生物學(xué)鑒定。 2.各菌株行紅霉素標(biāo)準(zhǔn)藥物的體外藥敏實(shí)驗(yàn)，分成臨床耐藥菌株、臨床敏感菌株、標(biāo)準(zhǔn)菌株組。按CLSI及參考相

6、關(guān)文獻(xiàn)，制定本研究中紅霉素≥8μg/ml為耐藥菌株。 3.對(duì)各菌株行PCR分群，分成Parvo和T960兩個(gè)生物群，結(jié)合體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)，把兩群臨床耐藥菌株再各自分為高、中、低濃度耐藥三組，在兩群臨床敏感菌株中各自隨機(jī)抽取5株作為臨床敏感株對(duì)照組，標(biāo)準(zhǔn)菌株組同樣進(jìn)行PCR分群及體外藥物敏感試驗(yàn)作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。 4.對(duì)三組菌株進(jìn)行Uu紅霉素耐藥23SrRNA V區(qū)熱點(diǎn)突變的檢測(cè)：設(shè)計(jì)Uu23SrRNAV區(qū)熱點(diǎn)突變區(qū)特異性引物

7、，用PCR法擴(kuò)增熱點(diǎn)突變區(qū)片段并進(jìn)行全自動(dòng)測(cè)序獲得熱點(diǎn)突變區(qū)序列，與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)菌株序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)可能存在的熱點(diǎn)突變位點(diǎn)。 5.對(duì)三組菌株進(jìn)行Uu紅霉素耐藥的常見erm甲基化酶基因的檢測(cè)：應(yīng)用ermA、ermB、ermC特異性引物，用PCR法檢測(cè)Uu臨床耐藥組、臨床敏感組及標(biāo)準(zhǔn)菌株組是否存在相應(yīng)甲基化酶耐藥基因。 6、對(duì)三組菌株進(jìn)行Uu紅霉素耐藥的常見外排泵(mefA/E、msrA/B、mreA)的檢測(cè)：應(yīng)用mefA/E、m

8、srA/B、mreA特異性引物，用PCR法檢測(cè)Uu臨床耐藥組、臨床敏感組及標(biāo)準(zhǔn)菌株組是否存在相應(yīng)甲基化酶耐藥基因。 7.綜合分析耐藥基因的檢出及其與生物群別、耐藥濃度等關(guān)系，明確Uu可能的耐藥機(jī)制及耐藥規(guī)律，并分析其臨床意義。 結(jié)果： 1.73株臨床菌株經(jīng)培養(yǎng)鑒定及分子牛物學(xué)鑒定均符合Uu特征，經(jīng)體外藥物敏感試驗(yàn)及PCR分群，得耐藥菌株35株(47.95％)，其中Parvo生物群17株，T960生物群18株。

9、 2.臨床耐藥菌株組發(fā)現(xiàn)含ermB耐藥基因(占54.29％)及msrA/B耐藥基因(25.71％)，以ermB耐藥基因?yàn)橹?p=0.0273)；同時(shí)含有ermB和msrA/B耐藥基因2株(占5.71％)，未發(fā)現(xiàn)23SrRNA的V區(qū)點(diǎn)突變及ermA、ermC、mefA/E、mreA等其他可轉(zhuǎn)移耐藥基因，總耐藥基因發(fā)現(xiàn)率74.29％。臨床敏感菌株組及標(biāo)準(zhǔn)菌株組均未發(fā)現(xiàn)23SrRNA的V區(qū)點(diǎn)突變及可轉(zhuǎn)移耐藥基因的陽性擴(kuò)增。 3.臨

10、床耐藥菌株組Parvo生物群同時(shí)發(fā)現(xiàn)ermB及msrA/B兩種耐藥基因，兩者分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=1.0)；T960生物群發(fā)現(xiàn)的耐藥基因只有ermB，未發(fā)現(xiàn)msrA/B耐藥基因，兩者發(fā)現(xiàn)比率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.0003)。msrA/B耐藥基因在Parvo生物群及T960生物群兩個(gè)生物群發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.0003)。 4.ermB基因和msrA/B基因臨床耐藥組菌株高中低各濃度組的分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。分群后兩種耐藥

11、基因在各耐藥濃度上的分布差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)含有ermB和msrA/B耐藥基因位于Parvo生物群中度耐藥濃度組。 5.結(jié)合分群和耐藥濃度，msrA/B在中度耐藥濃度組兩群間分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.0256)，在高度及低度耐藥濃度組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ermB在各耐藥濃度組兩群間分布均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論： 1.Uu對(duì)紅霉素的豐要耐藥機(jī)制有甲基化酶機(jī)制(以ermB為主)和外排泵機(jī)制(以msrA/B為主)，未發(fā)