解脲脲原體與淋球菌耐藥表型及基因型的流行病學(xué)研究.pdf

1、目的：(1)調(diào)查江蘇省局部地區(qū)解脲脲原體的耐藥狀況并提出用藥建議；(2)研究江蘇省局部地區(qū)解脲脲原體的耐藥機(jī)制(包括對(duì)四環(huán)素類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物)；(3)根據(jù)解脲脲原體兩個(gè)不同基因型的基因組差別建立和評(píng)價(jià)新的基因分型方法，并進(jìn)行初步的臨床應(yīng)用；(4)研究江蘇省淋球菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制。研究方法：(1)用法國(guó)梅里埃支原體鑒定試劑盒進(jìn)行解脲脲原體(Uu)與人型支原體(Mh)的初步分離和鑒定，并對(duì)解脲脲原體培養(yǎng)陽(yáng)性物進(jìn)一步經(jīng)

2、過(guò)濾培養(yǎng)和特異性PCR試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)。(2)應(yīng)用微量肉湯稀釋法檢測(cè)八種抗生素(四環(huán)素、米諾環(huán)素、紅霉素、克拉霉素、阿齊霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星和左旋氧氟沙星)對(duì)確認(rèn)的84株解脲脲原體的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)。(3)按藥敏結(jié)果分層，從84株解脲脲原體菌株中隨機(jī)抽取34株，用PCR擴(kuò)增四環(huán)素耐藥基因tetM；隨機(jī)抽取28株，采用PCR擴(kuò)增氟喹諾酮耐藥基因gyrA的氟喹諾酮耐藥決

3、定區(qū)(QRDR)，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，采用Blast比對(duì)法比較臨床菌株序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株序列的差異。(4)基于解脲脲原體14個(gè)血清型的23S rRNA基因序列的差異，采用primei premier5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物和選取限制性?xún)?nèi)切酶，自行建立解脲脲原體的基因分型方法，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)菌株和“金標(biāo)準(zhǔn)”鑒定的臨床菌株比較，對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)并初步應(yīng)用于臨床菌株進(jìn)行基因分型和分析。(5)根據(jù)淋球菌藥敏結(jié)果，從已經(jīng)鑒定為淋球菌的95株菌株中，分層

4、隨機(jī)抽取54株，采用PCR擴(kuò)增氟喹諾酮耐藥基因g3mA和parC的QRDR，并進(jìn)行DNA測(cè)序，分析其突變位點(diǎn)與藥敏結(jié)果MIC的相關(guān)關(guān)系。(6)結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和流行病學(xué)調(diào)查資料，采用卡方檢驗(yàn)、方差分析、秩和檢驗(yàn)和精確概率法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 研究結(jié)果：(1)解脲脲原體對(duì)米諾環(huán)素、四環(huán)素、克拉霉素、阿齊霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星和左旋氧氟沙星的MIC<,50>(50﹪的菌株被抑制的濃度)分別為<0.0625、<0.125、0.

5、25、1、2、8、4和2mg/L；MIC<,90>(90﹪的菌株被抑制的濃度)分別為0.125、1、1、4、8、64、16和8mg/L。(2)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素(克拉霉素、阿齊霉素和紅霉素)的耐藥水平(包括MIC幾何均數(shù)和耐藥率)在有Mh合并感染組與無(wú)Mh合并感染組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，伴隨Mh感染的解脲脲原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的MIC水平和耐藥率都較高。(3)在34株非四環(huán)素耐藥的解脲脲原體菌株中，有7株檢測(cè)到tetM基因。t

6、etM基因陽(yáng)性組的四環(huán)素和米諾環(huán)素的MIC水平都比tetM陰性組高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(四環(huán)素：t=-4.34，P=0.0001：米諾環(huán)素：t=-5.90，P<0.0001)。在28株解脲脲原體菌株中，經(jīng)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)gyrA基因出現(xiàn)三種突變形式：①302位堿基C→T的突變，導(dǎo)致101位(相當(dāng)于大腸桿菌84位)丙氨酸改變?yōu)槔i氨酸：②336位堿基C→A的突變，導(dǎo)致112位(相當(dāng)于大腸桿菌95位)天冬氨酸改變?yōu)楣劝彼幔孩?67位堿基T的缺失。發(fā)生

7、gyrA基因突變的主要是耐藥菌株和中度敏感菌株，在敏感菌株沒(méi)有發(fā)現(xiàn).gyrA基因突變；所有有基因改變的菌株其氟喹諾酮類(lèi)藥物的MIC水平明顯高于沒(méi)有突變的菌株組。(4)在標(biāo)準(zhǔn)菌株中，PCR-RFLP(PCR為基礎(chǔ)的限制性酶切多態(tài)性分析)方法分型能力為100﹪，同時(shí)分型結(jié)果有較好的特異性和可重復(fù)性，電泳圖譜清晰易于分辨和解釋。在通過(guò)“金標(biāo)準(zhǔn)”鑒定的臨床菌株中，該分型方法的靈敏度為97﹪，特異度為89﹪，重復(fù)試驗(yàn)一致率為98﹪。PCR陽(yáng)性擴(kuò)增

8、模板兩次獨(dú)立分型實(shí)驗(yàn)的一致率為90.62﹪；PCR-RFLP分型結(jié)果與測(cè)序分型結(jié)果的一致率為100﹪。(5)有生殖道感染病史和合并Mh感染的解脲脲原體基因型主要表現(xiàn)為生物1型，而合并霉菌感染的解脲脲原體主要為混合型。不同型別的解脲脲原體對(duì)四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)藥物的敏感性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其MIC的平均水平均表現(xiàn)為T(mén)960型高于生物1型。解脲脲原體基因型與氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥相關(guān)的.gyrA基因的氨基酸改變有較強(qiáng)的相關(guān)性，出現(xiàn)氨基

9、酸Asp95Glu改變的菌株均屬于T960型，而無(wú)此改變的菌株均不屬于T960型。(6)分離的95株淋球菌對(duì)環(huán)丙沙星100﹪的耐藥；通過(guò)測(cè)序分析，在54株淋球菌中檢測(cè)到gyrA和parC的18種突變形式。環(huán)丙沙星的MIC水平在不同parC基因突變組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)，parC基因突變位點(diǎn)越少其MIC相對(duì)較低，突變位點(diǎn)越多其MIC相對(duì)較高。研究結(jié)論：(1)在江蘇局部地區(qū)第三代以前的氟喹諾酮類(lèi)藥物和紅霉素MIC水平較高，

10、耐藥嚴(yán)重，此類(lèi)藥物不宜作為治療解脲脲原體感染的一線藥物，而四環(huán)素類(lèi)藥物可以重新作為治療解脲脲原體感染的一線藥物，尤其是米諾環(huán)素抗菌效果最好，其次為克拉霉素和阿齊霉素。(2)在非耐四環(huán)素類(lèi)的解脲脲原體菌株中也存在tetM基因的攜帶，但比例不高：解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥主要是由于gyrA基因突變導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸改變所介導(dǎo)。(3)PCR-RFLP基因分型試驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株中均有較高的靈敏度、特異度和可重復(fù)性，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分型

11、結(jié)果與酶切分型結(jié)果一致率較好，酶切圖譜清晰，結(jié)果易解釋?zhuān)囼?yàn)操作簡(jiǎn)單，儀器設(shè)備要求不高，適合大樣本的流行病學(xué)調(diào)查分型所用。(4)不同基因型別的解脲脲原體對(duì)四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)藥物的敏感性存在差異，T960型的MIC平均水平高于生物1型。解脲脲原體基因型與氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥相關(guān)的gyrA基因所表達(dá)的氨基酸改變有高度的相關(guān)性，在所選菌株中T960型均出現(xiàn)gyrA編碼氨基酸Asp95Glu的改變。(5)江蘇淋球菌對(duì)環(huán)丙沙星藥物耐藥