解脲脲原體基因突變導致對司帕沙星耐藥的研究.pdf

1、目的：l.研究解脲脲原體(Uu)編碼Ⅱ型拓撲異構酶的基因喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)突變與喹諾酮耐藥的關系。 2．研究司帕沙星對Uu有無明確的首要靶酶。 3．如果司帕沙星對Uu有明確的首要靶酶，它是DNA促旋酶還是拓撲異構酶IV。 4．對司帕沙星耐藥的Uu是否對其他喹諾酮類藥物交叉耐藥。 方法：提取對喹諾酮類藥物敏感的Uu臨床分離株的。DNA，對其編碼DNA促旋酶和拓撲異構酶IV的基因的QRDR進行：PC

2、R擴增，然后對擴增產物測序，并測司帕沙星、環(huán)丙沙星、氟羅沙星、依諾沙星對其的最低抑菌濃度(MIC)。將37℃中24h內顏色未改變的最末一管的藥物濃度定為MIC。24h之后，待試管內液體培養(yǎng)基顏色不再發(fā)生改變時，取其中顏色發(fā)生改變且司帕沙星濃度最大的一管在瓊脂培養(yǎng)基上劃板并培養(yǎng)，然后挑2個菌落(即2個第一代耐藥突變株)用液體培養(yǎng)基增菌。提取2個增菌產物的DNA，用PCR對其QRDR進行擴增，然后對擴增產物進行測序，并測4種喹諾酮對其的MI

3、C。24h觀察MIC的結果，并繼續(xù)培養(yǎng)直至試管內液體培養(yǎng)基的顏色不再發(fā)生改變。用于測司帕沙星對2個第一代耐藥突變株MIC的2套試管中各取其中顏色發(fā)生改變且司帕沙星濃度最大的一管在瓊脂培養(yǎng)基上劃板并培養(yǎng)，再各挑1個菌落(即2個第二代耐藥突變株)用液體培養(yǎng)基增菌。提取2個增菌產物的DNA，用PCR對其QRDR進行擴增，然后對擴增產物進行測序，并測4種喹諾酮對其的MIC。實驗設置臨床分離株及耐藥株的對照。將Uu標準株、臨床分離株以及兩代四份耐

4、藥突變株的MIC及QRDR基因序列進行對比，分析基因突變與耐藥的聯(lián)系。 結果：兩份第一代耐藥突變株均在編碼DNA促旋酶的基因的QRDR上發(fā)生了點突變，雖然具體位點不同，但都對司帕沙星產生了相對較低水平的耐藥；兩份第二代耐藥突變株則在繼承了前代的點突變之后，均在編碼拓撲異構酶IV的基因的QRDR上發(fā)生了額外的點突變，對司帕沙星產生了相對較高水平的耐藥。且四份耐藥突變株對另外三種喹諾酮藥物也產生了耐藥性。 結論：1．編碼II

5、型拓撲異構酶的基因ORDR突變可導致Uu對司帕沙星產生耐藥，并可對其他喹諾酮類藥物(環(huán)丙沙星、氟羅沙星、依諾沙星)產生交叉耐藥。 2．司帕沙星對Uu的DNA促旋酶和拓撲異構酶IV的作用有選擇性，司帕沙星對Uu的首要靶酶是。DNA促旋酶。 3．DNA促旋酶單獨突變可導致Uu對司帕沙星發(fā)生相對較低水平的耐藥，而DNA促旋酶和拓撲異構酶IV均發(fā)生突變，則可導致Uu對司帕沙星相對較高水平的耐藥。 4．司帕沙星誘導產生的耐