NF-κB-SREBPs途徑介導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇流出和炎癥因子的產(chǎn)生.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis, As）是一種慢性炎癥性病理過程，炎癥刺激在動(dòng)脈粥樣硬化的起始、進(jìn)展以及并發(fā)癥的產(chǎn)生中起重要作用。核因子-kappa B(NF-κB)是炎癥因子產(chǎn)生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中可檢測(cè)到活化的NF-κB，特異性的沉默或抑制 NF-κB通路可減輕動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積，并減少其并發(fā)癥。NF-κB促動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制主要是由炎癥因子介導(dǎo)，但近期的研究發(fā)現(xiàn)NF-κB可促進(jìn)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積，這為

2、我們認(rèn)識(shí)NF-κB的促動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制提供了新的研究方向。
　　固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（Sterol-regulatory element binding proteins, SREBPs）是體內(nèi)膽固醇生物合成和攝取相關(guān)基因的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。目前已確定的SREBPs異構(gòu)體有3種：SREBP-1a、1c和2。SREBPs彼此之間存在相關(guān)性，但也有差異：SREBP-1a和SREBP-1c易于激活脂肪酸和三酰甘油合成過程中的基因，而SREB

3、P-2易于激活LDL受體基因和多個(gè)膽固醇合成所必需的基因。在SREBPs的內(nèi)含子區(qū)域，含有新發(fā)現(xiàn)的一類microRNAs（miRNAs），miR-33s。已知miRNAs是一類具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)活性的單鏈小分子RNA，已有研究表明miRNAs參與調(diào)控脂質(zhì)代謝及炎癥因子表達(dá)，介導(dǎo) As的形成。miR-33s的主要靶基因是三磷酸腺苷結(jié)合盒A1（ATP binding cassette transporter A1， ABCA1）。由于ABCA1

4、是介導(dǎo)細(xì)胞脂質(zhì)流出的主要膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，抑制其表達(dá)后將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蓄積大量的脂質(zhì)，最終形成泡沫細(xì)胞。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制miR-33s表達(dá)，可促進(jìn)ABCA1表達(dá)和膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)（RCT），并明顯減少斑塊面積。因此，miR-33s已成為防治As性疾病的重要靶標(biāo)。然而，體內(nèi)對(duì)miRNAs的調(diào)控研究目前還處在起步階段，miR-33s在體內(nèi)的受控機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明。
　　越來越多的證據(jù)顯示固有免疫應(yīng)答與多種疾病包括As密切相關(guān)。NOD樣受體（NLRs）

5、是細(xì)胞內(nèi)感受微生物或非微生物信號(hào)的模式識(shí)別受體，NLRs能形成細(xì)胞內(nèi)大的蛋白復(fù)合體，稱為“炎性體”，包括NLRs、caspase1和ASC。炎性體的作用是形成一個(gè)活化caspase1的支架，促進(jìn)pro-IL-1β和pro-IL-18分別轉(zhuǎn)化為成熟的IL-1β和IL-18。IL-1β和IL-18與As的發(fā)展關(guān)系密切，在實(shí)驗(yàn)性的小鼠中發(fā)現(xiàn)，若缺乏IL-1β或IL-18，則明顯限制As的發(fā)展。然而，炎性體在體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制還不甚清楚。
　

6、　通過生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)miR-33s宿主基因SREBPs的啟動(dòng)子區(qū)存在NF-κB反應(yīng)元件（κBREs），提示NF-κB可能通過直接結(jié)合SREBPs的啟動(dòng)子，進(jìn)而調(diào)控SREBPs和miR-33s的表達(dá)。為了探討SREBPs和miR-33s在NF-κB促As中的可能作用及機(jī)制，因此，我們首先在第一部分中觀察了NF-κB對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇流出及炎癥因子表達(dá)的影響，然后，在第二部分中我們研究了NF-κB對(duì)SREBPs和miR-33s表達(dá)的

7、作用及機(jī)制，并探討了miR-33s在NF-κB抑制膽固醇流出中的作用，以及 SREBPs在NF-κB促炎癥因子釋放和炎性體表達(dá)中的作用，接著，在第三部分中，我們?cè)隗w內(nèi)觀察了NF-κB-SREBPs途徑在As和炎癥反應(yīng)中的作用，最后，在第四部分中，我們觀察了具有明顯抗炎效應(yīng)的白樺脂酸（betulinic acid，BA）在體內(nèi)外對(duì)NF-κB-SREBPs途徑的影響，并深入探討了其作用機(jī)制。本研究為揭示NF-κB-SREBPs途徑在As發(fā)生

8、發(fā)展中的可能作用和機(jī)制提供新的研究思路。
　　第一部分 NF-κB對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇流出及炎癥因子表達(dá)的影響
　　目的：觀察NF-κB對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇流出及相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCA1的影響，并觀察NF-κB對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響。
　　方法：培養(yǎng) THP-1細(xì)胞株，用160nmol/L的佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate，PMA)刺激細(xì)胞24 h，使其誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞。以100μg/ml的氧化型

9、低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，oxLDL）分別孵育THP-1和RAW264.7巨噬細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。兩種細(xì)胞分別分為3組：對(duì)照組， LPS組（10 ng/ml，24 h）和LPS+PDTC組（LPS10 ng/ml，PDTC50μM，24 h）。以液體閃爍計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出，熒光定量 PCR檢測(cè) ABCA1的mRNA表達(dá)，Western blotting免疫印跡法檢測(cè)A

10、BCA1的蛋白表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）法檢測(cè)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα, TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β, IL-1β）、和IL-6的表達(dá)。
　　結(jié)果：用LPS處理THP-1和RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞后，載脂蛋白A1（apolipoprotein A-I, apoA-I）介導(dǎo)的膽固醇流出明顯減少；相應(yīng)的，ABCA1 mRNA和蛋白含量明顯下降。使用

11、NF-κB特異性的抑制劑PDTC處理巨噬細(xì)胞，可明顯減少LPS所致的膽固醇流出下降，并減弱LPS所致的ABCA1表達(dá)下降。此外，PDTC處理可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌。
　　結(jié)論：① NF-κB可抑制巨噬細(xì)胞膽固醇流出，下調(diào)ABCA1表達(dá)；② NF-κB可促進(jìn)TNFα、IL-6和IL-1β等炎癥因子產(chǎn)生。
　　第二部分 SREBPs介導(dǎo)NF-κB調(diào)控膽固醇流出和炎癥因子表達(dá)的機(jī)制

12、r>　　目的：探討NF-κB調(diào)控巨噬細(xì)胞膽固醇流出和炎癥因子表達(dá)的可能分子機(jī)制。
　　方法：培養(yǎng)THP-1細(xì)胞株，以PMA和ox-LDL建立THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型。10 ng/ml LPS處理3h后，加入放線菌素D（actinomycin D, Act D）（5μg/ml）終止轉(zhuǎn)錄，采用定量PCR檢測(cè)ABCA1 mRNA的表達(dá)，觀察ABCA1 mRNA穩(wěn)定性變化。以LPS處理細(xì)胞，觀察 NF-κB對(duì)miR-33s及其宿

13、主基因SREBPs表達(dá)影響的濃度效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。PDTC處理，觀察抑制 NF-κB對(duì)miR-33s/SREBPs的表達(dá)變化。制備SREBPs啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒，與表達(dá)載體p50(pRSV-NF-κB-1)和p65（pRSV-RelA）共同轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告基因分析 NF-κB對(duì)SREBPs啟動(dòng)子的激活作用。染色體免疫共沉淀（ChIP）檢測(cè)NF-κB是否可直接結(jié)合在SREBPs的啟動(dòng)子上。用miR-33a/b m

14、imic（40 nM）增加miR-33s的表達(dá)，用拮抗劑anti-miR-33a/b（60 nM）降低miR-33s 的表達(dá)，檢測(cè)ABCA1表達(dá)以及細(xì)胞膽固醇的流出情況，判斷miR-33s在其中的作用。用SREBPs siRNA處理巨噬細(xì)胞，研究SREBPs在炎癥因子表達(dá)中的作用。
　　結(jié)果：NF-κB活化后，ABCA1 mRNA的降解速度明顯加快，NF-κB可增加細(xì)胞SREBP-2/miR-33a和SREBP-1a/m

15、iR-33b mRNA的表達(dá)，以及SREBPs蛋白水平。轉(zhuǎn)染NF-κB后，SREBPs啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因值明顯升高，而κBRE突變后，NF-κB對(duì)SREBPs啟動(dòng)子的作用消除。ChIP檢測(cè)進(jìn)一步證明了NF-κB可直接結(jié)合到SREBPs啟動(dòng)子上。LPS活化NF-κB后，再加入miR-33a/b mimic， ABCA1表達(dá)進(jìn)一步下降，相反，加入anti-miR-33a/b后，NF-κB對(duì)ABCA1的抑制作用得到有效緩解。相應(yīng)的，加入m

16、iR-33a/b mimic后，膽固醇流出明顯下降，而加入anti-miR-33a/b后，膽固醇流出得以部分恢復(fù)。SREBP-2或 SREBP-1抑制后，明顯降低LPS誘導(dǎo)的IL-1β上調(diào)，但對(duì)TNF-α、IL-6和IL-18的表達(dá)無明顯影響。炎性體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抑制SREBPs后，NLRP1表達(dá)下降，而NLRP3無明顯影響。進(jìn)一步使用siRNA抑制NLRP1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NF-κB對(duì)IL-1β的誘導(dǎo)作用明顯下降。
　　結(jié)論：① SRE

17、BPs是NF-κB的直接靶基因；② NF-κB通過促進(jìn)miR-33s表達(dá)調(diào)控ABCA1及膽固醇流出；③ NF-κB通過促進(jìn)SREBPs表達(dá)調(diào)控NLRP1炎性體及IL-1β產(chǎn)生。
　　第三部分 NF-κB對(duì)apoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變及體內(nèi)炎癥因子表達(dá)水平的影響
　　目的：以apoE基因敲除（apoE-KO）小鼠為研究對(duì)象，觀察NF-κB對(duì)體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化病變、膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)（RCT）、炎癥及NF-κB-SREBPs途徑

18、相關(guān)分子的表達(dá)變化。
　　方法：8周齡雄性apoE-KO小鼠以普通飼料飼養(yǎng)，并隨機(jī)分為三組：對(duì)照組、LPS組和LPS+PDTC組（每組15只）。其中，對(duì)照組每周腹腔注射與實(shí)驗(yàn)組同等劑量的生理鹽水；LPS組每周腹腔注射 LPS(2.5 mg/kg body wt)1次；LPS+PDTC組每周腹腔注射LPS(2.5 mg/kg body wt)和PDTC(50 mg/kg body wt) 1次。8周后處死動(dòng)物，采用酶氧化法

19、檢測(cè)甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）等血脂水平；油紅 O染色觀察主動(dòng)脈和主動(dòng)脈竇處脂質(zhì)蓄積情況；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68和NF-κB的表達(dá)；Masson氏染色法檢測(cè)斑塊處膠原纖維面積；ELISA法檢測(cè)血清炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β和MCP-1等)的表達(dá)。液體閃爍計(jì)數(shù)儀檢測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞來源的RCT效率。提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，熒光定量PCR法和western-blot法檢測(cè)SREBPs、miR-33、ABCA1、

20、ABCG1、NLRPs和NF-κB的表達(dá)。
　　結(jié)果：與對(duì)照組比較，LPS組小鼠血漿TG、TC和LDL-C含量明顯增高，而HDL-C則水平降低，加入PDTC后，HDL-C水平有明顯回升。PDTC明顯減少LPS所致的主動(dòng)脈竇和主動(dòng)脈上的As病變面積增加；增加糞便中的膽固醇流出，而肝臟和血液中的膽固醇流出沒有明顯改變；降低小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中miR-33表達(dá)，促進(jìn)ABCA1和ABCG1的表達(dá)。PDTC處理后，與LPS組比較，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)

21、減少而膠原纖維增加；斑塊處NF-κB的表達(dá)下降；血液中TNF-α、IL-1β和MCP-1等炎癥因子表達(dá)水平降低；腹腔巨噬細(xì)胞中SREBPs和NLRPs的表達(dá)下降。
　　結(jié)論：①體內(nèi)NF-κB活化可促進(jìn)miR-33和SREBPs表達(dá)，抑制ABCA1和ABCG1的表達(dá)，抑制體內(nèi)RCT并促進(jìn)As；②體內(nèi)NF-κB活化可增加炎癥因子水平，并促進(jìn)NLRPs表達(dá)。
　　第四部分白樺脂酸對(duì)ABCA1表達(dá)和炎癥因子釋放的影響及機(jī)制
　

22、　目的：觀察白樺脂酸對(duì)ABCA1表達(dá)和炎癥因子釋放的影響并探討其機(jī)制。
　　方法：培養(yǎng)THP-1細(xì)胞株，以PMA和ox-LDL建立THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型。以不同濃度（0,0.5,1,2μg/ml）BA處理24 h或1μg/ml BA處理不同時(shí)間（0,12,24 and48 h），然后再加入LPS（10ng/ml）作用24 h，觀察BA預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的膽固醇流出和ABCA1表達(dá)抑制的影響。高效液相色譜檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇

23、含量；熒光定量 PCR檢測(cè) BA處理對(duì)miRNA-33s及其宿主基因SREBPs表達(dá)的影響；用 miR-33a/b mimic增加 miR-33s的表達(dá)，用拮抗劑 anti-miR-33a/b降低miR-33s的表達(dá)，檢測(cè)ABCA1表達(dá)情況，判斷miR-33s在BA促膽固醇流出中的作用；western-blot法檢測(cè)NF-κB的核轉(zhuǎn)錄水平，使用NF-κB特異性的抑制劑PDTC(50μM)或Bay11-7082(5μM)處理細(xì)胞，再加入B

24、A和LPS，熒光定量PCR檢測(cè)miR-33s和ABCA1的mRNA表達(dá)，液體閃爍計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出，以明確 NF-κB在 BA促膽固醇流出中的作用；進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)中IκBα、磷酸化IκBα和細(xì)胞核中磷酸化NF-κB p65的表達(dá)，以及巨噬細(xì)胞炎癥因子的分泌情況，以明確BA的抗炎作用及其機(jī)制。以apoE基因敲除小鼠為研究對(duì)象，觀察 BA對(duì)體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化病變和體內(nèi)炎癥反應(yīng)的影響。
　　結(jié)果：BA預(yù)處理明顯減弱LPS對(duì)巨噬

25、細(xì)胞膽固醇流出和ABCA1表達(dá)的抑制，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)總膽固醇、膽固醇酯和游離膽固醇的含量。BA預(yù)處理有效抑制miR-33s及其宿主基因SREBPs表達(dá)。加入anti-miR-33a/b后，與單加LPS組比較，ABCA1的表達(dá)明顯升高，而加入miR-33a/b mimic，ABCA1的表達(dá)則無明顯改變；加入BA后，再加入anti-miR-33a/b，ABCA1的表達(dá)無明顯變化，而加入miR-33a/b mimic，ABCA1的含量明顯下降。B

26、A處理可抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)錄水平； PDTC或Bay11-7082可增強(qiáng)BA對(duì)miR-33s的抑制作用，同時(shí)增強(qiáng)BA對(duì)ABCA1表達(dá)及膽固醇流出的促進(jìn)作用。BA處理后，細(xì)胞質(zhì)中磷酸化IκBα的表達(dá)明顯下降，細(xì)胞核中磷酸化NF-κB p65的表達(dá)，炎癥因子分泌水平降低。LPS組小鼠較對(duì)照組小鼠血漿TG、TC和LDL-C含量明顯增高，而HDL-C則水平降低，BA處理后，TG、TC和LDL-C含量下降，HDL-C水平明顯回升。組LPS組比較