NF-κB信號(hào)通路在肺炎衣原體誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞膽固醇代謝失衡中的作用.pdf

1、第一部分肺炎衣原體感染巨噬細(xì)胞對(duì)NF-κB通路激活的影響
　　目的:以THP-1(人急性白血病單核細(xì)胞)源性巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象觀察肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae,C.pn)感染對(duì)核因子-κB(NF-κB)通路激活的影響。
　　方法:用160nmol/L佛波酯孵育THP-1細(xì)胞24~48小時(shí),倒置顯微鏡下觀察,見其分化為巨噬細(xì)胞后,隨機(jī)分為4組:(1)陰性對(duì)照組:予以含有50μg/mL低密度脂蛋白(LDL)

2、的培養(yǎng)基孵育48h;(2)陽(yáng)性對(duì)照組:予以含有50μg/mL氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的培養(yǎng)基孵育48h;(3)C.pn感染濃度組:在予以50μg/mLLDL孵育條件下,分別給予1×105、4×105、5×105、1×106IFUC.pn感染48h;(4)C.pn感染時(shí)間組:在予以50μg/mLLDL孵育條件下,給予1×106IFUC.pn分別感染24h、48h、72h。用凝膠電泳遷移法(electrophoreticmobil

3、ityshiftassay,EMSA)檢測(cè)C.pn感染對(duì)NF-κB通路激活的影響。
　　結(jié)果:陰性對(duì)照組的NF-κB通路未見激活,陽(yáng)性對(duì)照組、C.pn感染濃度組和C.pn感染時(shí)間組的NF-κB通路有明顯激活。NF-κB的活性隨C.pn感染濃度的增大而增加。相同劑量的C.pn感染,在感染24h時(shí)對(duì)NF-κB的激活達(dá)到最大效應(yīng),隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng),在48h和72h時(shí),NF-κB的活性逐漸下降。
　　結(jié)論:在負(fù)荷LDL的情況下,C

4、.pn感染可呈濃度依賴性地激活NF-κB通路,且在感染24h時(shí)有最大的激活效應(yīng),為我們進(jìn)一步研究NF-κB在C.pn感染介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了理論基礎(chǔ)。
　　第二部分NF-κB信號(hào)通路在肺炎衣原體誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞泡沫化中的作用
　　目的:以THP-1源性巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象,利用RNA干擾基因沉默(RNAi)技術(shù)沉默NF-κBP65基因表達(dá)以抑制NF-κB的活性后,觀察NF-κB活性抑制在C.pn感染

5、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用。
　　方法:首先針對(duì)NF-κB基因的P65亞基,將人工設(shè)計(jì)合成的一組熒光標(biāo)記的陰性對(duì)照序列、一組普通陰性對(duì)照(negativecontrolsiRNA)序列和3組NF-κBP65siRNA(NF-κBP65siRNA1~3)序列分別轉(zhuǎn)染入細(xì)胞,使用熒光顯微鏡觀察法直接觀察熒光標(biāo)記的陰性對(duì)照序列的轉(zhuǎn)染效率,使用RealTime-PCR(RT-PCR)和westernblot檢測(cè)NF-κBP65mR

6、NA和蛋白的表達(dá),篩選出抑制效率高的序列。隨之,用negativecontrolsiRNA和篩選出的高效NF-κBP65siRNA序列分別轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞24h,在予以50μg/mLLDL孵育條件下給予C.pn感染32h,用油紅O染色法觀察巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)脂滴的變化并計(jì)數(shù)各組的泡沫細(xì)胞數(shù)量。
　　結(jié)果:在熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)siRNA呈綠色熒光,熒光細(xì)胞的百分率即代表轉(zhuǎn)染效率,轉(zhuǎn)染效率為83.33％±2.52。與普通陰性對(duì)照組相

7、比,三組NF-κBP65siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后,NF-κBP65mRNA和蛋白表達(dá)都有下調(diào),其中NF-κBP65siRNA1和NF-κBP65siRNA3對(duì)靶基因的抑制效果佳。在轉(zhuǎn)染NF-κBP65siRNA后,感染C.pn的巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)脂滴的數(shù)目及體積明顯減少、所形成的的泡沫細(xì)胞數(shù)目亦明顯減少。
　　結(jié)論:干擾序列的轉(zhuǎn)染效率高,NF-κBP65siRNA1和siRNA3轉(zhuǎn)染后能明顯抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κBP65的表達(dá)。NF-

8、κB基因沉默可使C.pn感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成減少。
　　第三部分NF-κB信號(hào)通路在肺炎衣原體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化中對(duì)膽固醇代謝關(guān)鍵基因的調(diào)控作用
　　目的:觀察NF-κB信號(hào)通路在C.pn誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞泡沫化中對(duì)膽固醇代謝關(guān)鍵基因?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1(ACATl)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子Al/G1(ABCA1/G1)、A1型清道夫受體(SR-A1)的調(diào)控作用。
　　方法:用160nmo

9、l/L佛波酯孵育THP-1細(xì)胞24~48小時(shí),倒置顯微鏡下觀察,見其分化為巨噬細(xì)胞后,隨機(jī)分為3組:(1)negativecontrolsiRNA組:negativecontrolsiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后,在予以50μg/mLLDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h;(2)P65siRNA1組:NF-κBP65siRNA1轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后,在予以50μg/mLLDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h;(3)

10、P65siRNA3組:NF-κBP65siRNA3轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后,在予以50μg/mLLDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h。運(yùn)用分別運(yùn)用RT-PCR和Westernblot檢測(cè)ACATl、ABCA1/G1、SR-A1mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:與negativecontrolsiRNA組相比,NF-κBP65基因沉默后,再予以C.pn感染可致ACATl、ABCA1/G1mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào),SR-A

11、1mRNA和蛋白表達(dá)大體趨勢(shì)上無(wú)明顯改變。提示C.pn感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成,與NF-κB信號(hào)通路對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝關(guān)鍵基因ACATl、ABCA1/G1、SR-A1的調(diào)控有關(guān)。
　　結(jié)論:NF-κB通路在肺炎衣原體誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞泡沫化的過(guò)程中,可通過(guò)調(diào)控膽固醇代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)而影響膽固醇代謝的穩(wěn)態(tài),這可能是肺炎衣原體介導(dǎo)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)制之一。
　　第四部分NF-κB和PPARα/γ信

12、號(hào)通路在肺炎衣原體感染誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化中的交互作用
　　目的:觀察NF-κB和PPARα/γ信號(hào)通路在C.pn誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞泡沫化中的交互作用。
　　方法:用160nmol/L佛波酯孵育THP-1細(xì)胞24~48小時(shí),倒置顯微鏡下觀察,見其分化為巨噬細(xì)胞后,分別進(jìn)行下述兩部分實(shí)驗(yàn),皆隨機(jī)分為三組。觀察NF-κB活性抑制對(duì)PPARα/γ的影響(1)negativecontrolsiRNA組:negativesiRN

13、A轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后,在予以50μg/mLLDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h;(2)P65siRNA1組:NF-κBP65siRNA1轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后,在予以50μg/mLLDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h;(3)P65siRNA3組:NF-κBP65siRNA3轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后,在予以50μg/mLLDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h。運(yùn)用RT-PCR和Westernblot檢測(cè)

14、PPARα、PPARγmRNA和蛋白的表達(dá),觀察PPARα/γ的激活改變對(duì)NF-κB的影響(1)陰性對(duì)照組:在予以50μg/mLLDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h;(2)非諾貝特組:予以20μM/LPPARα的激動(dòng)劑非諾貝特預(yù)孵育2h后,在給予50μg/mLLDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h;(3)羅格列酮組:予以20μM/LPPARγ的激動(dòng)劑羅格列酮預(yù)孵育2h后,在給予50μg/mLLDL孵育條

15、件下,用1×106IFUC.pn感染32h。運(yùn)用凝膠電泳遷移法檢測(cè)各組NF-κB的活性。
　　結(jié)果:與negativecontrolsiRNA組相比,P65siRNA1組和P65siRNA3組PPARα、PPARγmRNA和蛋白表達(dá)顯著增加,提示C.pn感染可通過(guò)NF-κB通路調(diào)節(jié)PPARα/γ基因的表達(dá);與單純的C.pn感染組相比,非諾貝特和羅格列酮預(yù)處理皆明顯抑制了NF-κB的激活,提示C.pn感染可通過(guò)PPARα/γ通路影響