甲基原薯蕷皂苷對THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出的影響.pdf

1、[目的]
　　 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是大多數(shù)心腦血管疾病發(fā)生的前期病理基礎(chǔ)，在AS發(fā)生發(fā)展過程中，巨噬細(xì)胞來源的泡沫細(xì)胞形成是動脈粥樣損傷形成的特征性改變，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇和膽固醇酯的流出是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞膽固醇動態(tài)平衡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。膽固醇以囊泡分泌途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)已得到公認(rèn)，而在此過程中有高密度載脂蛋白apoA-1的介導(dǎo)。甲基原薯蕷皂苷(methyl protodioscin，MPD)是一種重要的甾體皂苷

2、，臨床研究表明MPD可降低血漿總膽固醇含量、升高血漿HDL膽固醇水平，通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)成分改善高膽固醇血癥和AS，但其作用機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)擬分析MPD對apoA-1介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的影響，并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。
　　 [方法]
　　 1.巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型的建立。人急性單核細(xì)胞型白血病細(xì)胞（THP-1細(xì)胞）用160 nM佛波酯(phorbol-1-myristate-13-acetate，

3、PMA)作用24 h誘導(dǎo)分化為貼壁巨噬細(xì)胞，再加入50μg/ml乙?；兔芏戎鞍?acetylated low-density lipoprotein，Ac-LDL)孵育48h誘導(dǎo)分化為泡沫細(xì)胞。
　　 2.巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型的鑒定。泡沫細(xì)胞用4％多聚甲醛固定，經(jīng)0.5％油紅O染色、蘇木精復(fù)染后，置相差顯微鏡下觀察結(jié)果。用0.1％TritonX-100裂解巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞，分別加入0.4 U/ml膽固醇酯酶和0.4 U

4、/ml膽固醇氧化酶將樣品中的游離膽固醇和膽固醇酯全部轉(zhuǎn)化為膽甾烯酮，以標(biāo)準(zhǔn)膽甾烯酮作為外標(biāo)，高效液相色譜(HPLC)檢測各組峰面積，根據(jù)蛋白濃度計(jì)算游離膽固醇和總膽固醇含量。
　　 3.液體閃爍計(jì)數(shù)法測定泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率。0.5μCi[3H]-膽固醇與50μg/ml Ac-LDL混勻、室溫靜置10 min，加入PMA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中作用48 h后，用空白培養(yǎng)基平衡24 h(同時(shí)MPD組加入0.1 mg/ml MPD作用24

5、h)，再加入10μg/ml apoA-1作用24 h后收集各組培養(yǎng)基，0.1 M NaOH裂解各組細(xì)胞，液體閃爍計(jì)數(shù)儀測定各組培養(yǎng)基和細(xì)胞的cpm值（cpm值為[3H]-膽固醇放射強(qiáng)度，每分鐘計(jì)數(shù)）。膽固醇流出率(％)=培養(yǎng)基內(nèi)cpm/(培養(yǎng)基內(nèi)cpm+細(xì)胞內(nèi)cpm)×100。
　　 4.ABCA1、SREBP1和SREBP2 mRNA和蛋白表達(dá)變化分析。THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA、Ac-LDL誘導(dǎo)分化為泡沫細(xì)胞后，分為Ac-LDL

6、組、apoA-1組和MPD組，根據(jù)ABCA1、SREBP1和SREBP2在GeneBank中的序列設(shè)計(jì)合成引物，提取細(xì)胞總RNA、逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)定量PCR檢測mRNA水平的變化。裂解各組細(xì)胞收集總蛋白，SDS-PAGE電泳分離、電轉(zhuǎn)移后，加入特異性抗體，Western blot檢測ABCA1、SREBP1和SREBP2蛋白表達(dá)變化。
　　 [結(jié)果]
　　 1.油紅O染色鑒定巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型。50tg/ml Ac-L

7、DL作用于巨噬細(xì)胞48 h，0.5％油紅O染色后，鏡下可觀察到細(xì)胞核被染成藍(lán)色，胞漿內(nèi)有大量紅色脂滴形成，胞漿呈泡沫狀改變。
　　 2.HPLC法鑒定巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品膽甾烯酮濃度、峰面積和樣品蛋白濃度、峰面積計(jì)算可得:泡沫細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇含量為6.52±0.42 mg/g細(xì)胞蛋白、總膽固醇含量為16.05±1.05 mg/g細(xì)胞蛋白，膽固醇酯含量為9.53±0.98 mg/g細(xì)胞蛋白（總膽固醇含量-游離膽固醇

8、含量）。與對照巨噬細(xì)胞相比，泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯占總膽固醇含量的（59.4±3.3）％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 3.液體閃爍計(jì)數(shù)法測定泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率。與apoA-1組相比，MPD處理組膽固醇流出率為（14.08±1.27）％，增加了（38.3±8.1）％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說明MPD可明顯促進(jìn)泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出。
　　 4.實(shí)時(shí)定量PCR檢測ABCA1、SREBP1和SREBP2

9、 mRNA水平變化，結(jié)果顯示與apoA-1組相比，MPD處理組ABCA1 mRNA表達(dá)水平提高了39.6％，SREBP1 mRNA表達(dá)水平降低了43.2％、SREBP2 mRNA表達(dá)水平降低了42.3％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 5.Western blot分析ABCA1、SREBP1和SREBP2蛋白表達(dá)變化，其結(jié)果與mRNA水平變化具有一致性。與apoA-1組相比，MPD處理組ABCA1蛋白水平表達(dá)量增加了4