核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)對腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶1(ANT1)的調(diào)控機(jī)制及其對線粒體功能影響的研究.pdf

1、研究背景
　　線粒體是細(xì)胞內(nèi)ATP和活性氧(ROS)產(chǎn)生的主要場所。越來越多的研究表明，線粒體功能異常與許多年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性病變密切相關(guān)，例如阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease，AD)，帕金森病(Parkinson's disease，PD)和亨廷頓病(Huntington's，HD)等。AD以細(xì)胞外β-淀粉樣肽(Aβ)沉積形成的老年斑，tau蛋白高度磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)元纖維纏結(jié)和伴有神經(jīng)元凋亡為主要病理表現(xiàn)，

2、以認(rèn)知能力進(jìn)行性減退和進(jìn)行性癡呆為臨床特征，是老年人癡呆中最常見的類型。AD的發(fā)病機(jī)制并不明確，但大量研究表明神經(jīng)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激在AD的病理變化中廣泛存在。
　　神經(jīng)元的炎癥反應(yīng)包括小膠質(zhì)細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的激活，進(jìn)而導(dǎo)致的細(xì)胞因子，趨化因子，神經(jīng)遞質(zhì)和活性氧ROS等炎性分子的釋放。炎癥信號通路和線粒體功能異常密切聯(lián)系，所以對兩者內(nèi)在相互作用的探究是十分有必要的。
　　腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶1(ANT1)

3、定位于細(xì)胞線粒體內(nèi)膜，占線粒體內(nèi)膜蛋白總量的大約10％。ANT1的主要功能包括介導(dǎo)線粒體內(nèi)ATP和線粒體外ADP的交換，調(diào)控偶聯(lián)和質(zhì)子漏。此外，ANT1還和電壓依賴性陰離子通道(VDAC)，親環(huán)素D(CyPD)共同形成了線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)復(fù)合體。因此，ANT1的穩(wěn)定表達(dá)對維持線粒體的正常功能極其重要。
　　線粒體是多種炎癥因子作用的靶細(xì)胞器，大多數(shù)的炎癥相關(guān)因子都能引起線粒體功能異常。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)是在

4、炎癥反應(yīng)，腫瘤生成和凋亡過程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子之一。未被激活的NF-κB和IκBα在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)合并穩(wěn)定存在，而NF-κB被激活后會入核，參與調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。腫瘤壞死因子α（TNFα）和脂多糖(LPS)是常見的NF-κB信號通路激活劑，大量相關(guān)報(bào)道也證實(shí)它們與線粒體的功能異常密切相關(guān)。
　　此前的研究表明，TNFα可以抑制ANT1的蛋白表達(dá)水平，但具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此我們重點(diǎn)探究在膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元等神經(jīng)細(xì)胞中NF-

5、κB信號通路對ANT1調(diào)控及其作用機(jī)制和對線粒體相關(guān)的病理生理改變的影響。這一課題可以為神經(jīng)退行性病變的中炎癥反應(yīng)和線粒體功能障礙的發(fā)生機(jī)理提供新的解釋，為相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供新的方向。
　　第一部分 NF-κB對ANT1的調(diào)控機(jī)制
　　研究目的:
　　探究核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)對腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶1(ANT1)表達(dá)的影響，以及其對ANT1的調(diào)控機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.NF-κB對ANT

6、1 mRNA表達(dá)量的影響
　　1.1將高表達(dá)IKK，NF-κB及空白對照的質(zhì)粒pIKK，pNF-κB和pcDNA3.1mychis分別轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR)和ANT1，TNFα, IκBα基因的特異性引物檢測其各自的mRNA表達(dá)量，β-actin為參照基因。

7、r>　　1.2將NF-κB信號通路的特異性抑制劑JSH-23，激動劑H2O2分別加入HEK293細(xì)胞中，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA后反轉(zhuǎn)為cDNA，用半定量PCR技術(shù)和ANT1，IκBα等基因的特異性引物檢測其各自的mRNA表達(dá)量，β-actin為參照基因。
　　2.NF-κB對ANT1的蛋白表達(dá)量的影響
　　2.1將高表達(dá)NF-κB的質(zhì)粒pNF-κB和NF-κB抑制劑JSH-23加入HEK293細(xì)胞中，提取細(xì)胞總蛋白，

8、利用蛋白印跡技術(shù)(Western blotting，WB)檢測ANT1和p65的蛋白表達(dá)量，β-actin為參照基因。
　　2.2將NF-κB信號通路的激活劑TNFα(10ng/ml)加入人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤T98G中，作用0，90，180和360 min后收集細(xì)胞并提取核蛋白，利用凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)檢測NF-κB的入核;提取細(xì)胞總RNA后采用實(shí)時(shí)熒光定量逆

9、轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time RT-PCR)法檢測ANT1的mRNA表達(dá)量。
　　2.3將NF-κB信號通路的激活劑TNFα(10ng/ml)加入T98G細(xì)胞中，作用0，90，180和360min后收集細(xì)胞并提取總蛋白，利用WB檢測ANT1，IκBα，COX-Ⅳ的蛋白表達(dá)量，β-actin為參照基因。
　　2.4將ANT1高表達(dá)質(zhì)粒p3xflag-cmv-ANT1轉(zhuǎn)染入T98G細(xì)胞，再將NF-κB信號通路的激活劑TN

10、Fα加入T98G細(xì)胞中，作用0，90，180和360min后收集細(xì)胞并提取總蛋白，利用WB和anti-flag抗體檢測外源性ANT1的蛋白表達(dá)量，β-actin為參照基因。
　　3.NF-κB對ANT1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
　　3.1采用機(jī)算機(jī)Jaspar軟件(Jaspar2016)預(yù)測NF-κB在ANT1啟動子上可能的結(jié)合位點(diǎn)(NF-κB responsive elements，NREs)。
　　3.2ANT1啟動子截短突變體

11、的構(gòu)建和活性檢測:結(jié)合預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)，利用PCR技術(shù)從細(xì)菌人工染色體中得到人的ANT1基因的啟動子序列，采用分子克隆技術(shù)插入到無啟動子活性的PGL3-BASIC載體中，構(gòu)成pANT1-lucs。將pNF-κB和截短體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞中，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)（Dual-luciferase assay）檢測ANT1啟動子的活性。
　　3.3采用染色質(zhì)免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，C

12、hIP)檢測NF-κB在ANT1啟動子上的NREs。
　　3.4采用EMSA技術(shù)進(jìn)一步確認(rèn)NF-κB在ANT1啟動子上的NREs。
　　4.統(tǒng)計(jì)分析
　　應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用t檢驗(yàn)和one-way ANOVA檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析;P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.NF-κB可以降低ANT1 mRNA的表達(dá)。
　　1.1外源高表達(dá)的NF-κB和IKK可以降低

13、內(nèi)源性的ANT1的mRNA的表達(dá)。同時(shí)檢測到作為NF-κB信號通路的下游靶基因的TNFα，IκBα的表達(dá)增加，因此提示NF-κB信號通路的激活可以抑制ANT1的轉(zhuǎn)錄。
　　1.2激活和抑制NF-κB信號通路后，內(nèi)源性ANT1的mRNA表達(dá)也相應(yīng)的降低和增加，因此證實(shí)ANT1是NF-κB信號通路的下游靶基因之一。
　　2.NF-κB可以降低ANT1蛋白的表達(dá)。
　　2.1同mRNA的表達(dá)變化相一致，外源高表達(dá)的NF-κB

14、可以降低內(nèi)源性ANT1的蛋白表達(dá)水平，而NF-κB抑制劑可以增加內(nèi)源性ANT1的蛋白表達(dá)水平。
　　2.2 TNFα可以激活內(nèi)源的NF-κB信號通路，并且在作用90min時(shí)NF-κB入核增加，且此時(shí)ANT1的mRNA和蛋白水平也相應(yīng)降低。
　　2.3 TNFα對外源性的ANT1的蛋白表達(dá)沒有影響，因此更加說明NF-κB信號通路是通過抑制ANT1的轉(zhuǎn)錄引起ANT1的mRNA和蛋白水平的降低。
　　3.ANT1基因啟動子上

15、NF-κB結(jié)合位點(diǎn)NREs為+1～+20bp和+41～+61bp。
　　3.1Luciferase結(jié)果顯示NF-κB可以降低ANT1啟動子截短突變體ANT1-LUCs的活性，且將可能的NRE范圍縮減至ANT1啟動子的+1～+61bp。ChIP結(jié)果也證實(shí)NF-κB可以結(jié)合在ANT1的該啟動子范圍上。
　　3.2采用Jaspar預(yù)測軟件預(yù)測ChIP驗(yàn)證的-74～+108bp的結(jié)合范圍，結(jié)果提示可能的NREs在+2～+14bp，+

16、20～+32bp和+49～+61bp。
　　3.3 EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)ANT1啟動子的NREs為+1～+20bp和+41～+61bp。
　　結(jié)論:
　　1.NF-κB可以降低ANT1基因的mRNA和蛋白水平。
　　2.ANT1的轉(zhuǎn)錄受NF-κB的調(diào)控，是NF-κB信號通路的下游靶基因。
　　3.ANT1啟動子上NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)位于+1～+20bp和+41～+61bp。
　　第二部分 NF-κB

17、信號通路的激活對線粒體功能的影響
　　研究目的:
　　探究NF-κB信號通路的激活劑腫瘤壞死因子α（TNFα）對線粒體功能的影響。
　　研究方法:
　　1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　1.1人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤T98G細(xì)胞的轉(zhuǎn)染:采用Lipofectamine2000將ANT1基因的敲低質(zhì)粒pSiANT1和其空白對照質(zhì)粒pSiCON轉(zhuǎn)染進(jìn)T98G細(xì)胞里，72h后收集細(xì)胞，采用WB檢測內(nèi)源性ANT1的敲低程度，β-actin為參

18、照基因。
　　1.2胎鼠神經(jīng)元的提取:取大鼠胚胎17-18天的胎鼠，斷頭取腦，分離硬軟腦膜，分離大腦皮層神經(jīng)元，利用木瓜蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)，貼壁培養(yǎng)5-7天后使用。
　　1.3胎鼠神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染:分別包裝含有SiANT1表達(dá)載體的慢病毒LV-SiANT1和其對照LV-SiCON，將其分別感染17-18天的胎鼠神經(jīng)元，72h后收集細(xì)胞，采用WB檢測內(nèi)源性ANT1的敲低程度，β-actin為參照基因。
　　2.細(xì)胞

19、凋亡
　　將TNFα(10ng/ml)加入T98G細(xì)胞，作用0，90，180和360 min后收集細(xì)胞并提取總蛋白，采用WB檢測cleaved-caspase3，total-caspase3的蛋白表達(dá)水平，β-actin為參照基因。
　　3.T98G細(xì)胞內(nèi)ANT1介導(dǎo)的ATP-ADP交換率
　　將TNFα作用于T98G細(xì)胞3h，ANT1高表達(dá)質(zhì)粒pANT1和ANT1敲低質(zhì)粒pSiANT1轉(zhuǎn)染入T98G細(xì)胞48h后加入D

20、igitonin進(jìn)行細(xì)胞通透。此后加入ADP(2mM)和Magnesium Green K+ salt（1μM），利用酶標(biāo)儀在505nm(Ex)/535nm(Em)波長測定熒光量，轉(zhuǎn)化為ATP量后計(jì)算出ATP-ADP交換率。
　　4.T98G細(xì)胞和胎鼠神經(jīng)元內(nèi)ATP量的測定
　　將pSiANT1和pSiCON轉(zhuǎn)染入T98G細(xì)胞，慢病毒LV-SiANT1和LV-SiCON感染胎鼠神經(jīng)元，72h后收集細(xì)胞，利用GloMax20/

21、20化學(xué)發(fā)光檢測儀和ATP檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)的ATP量。
　　5.T98G細(xì)胞和胎鼠神經(jīng)元內(nèi)線粒體mPTP孔開放的測定
　　將Calcin-AM(2μM)加入T98G細(xì)胞和胎鼠神經(jīng)元中37℃作用30min，PBS沖洗后加入CoCl2(1mM)處理30min，PBS沖洗后取一半細(xì)胞加入CaCl2(500μM)，ionomyc in(5μM)和CATR(1μM)或者BKA（5μM）處理30min，使用酶標(biāo)儀在494nm(Ex)

22、/517(Em)波長下檢測熒光量。與初始熒光量相比降低的熒光量代表了mPTP孔開放程度。
　　6.T98G細(xì)胞內(nèi)Ca2+介導(dǎo)的線粒體腫脹
　　將TNFα作用于T98G細(xì)胞3h，ANT1敲低質(zhì)粒pSiANT1轉(zhuǎn)染入T98G細(xì)胞48h后，提取T98G細(xì)胞的線粒體，用腫脹緩沖液重懸線粒體后加入CaCl2（100μM），用酶標(biāo)儀在540nm吸光度處連續(xù)檢測600s，降低的曲線即代表了線粒體腫脹的程度。
　　7.T98G細(xì)胞和胎

23、鼠神經(jīng)元內(nèi)線粒體膜電位(ΔΨm)的檢測將TNFα作用于T98G細(xì)胞3h，ANT1敲低質(zhì)粒pSiANT1轉(zhuǎn)染入T98G細(xì)胞72h，ANT1敲低慢病毒LV-SiANT1感染胎鼠神經(jīng)元72h后，加入TMRM(50nM)37℃作用90min，使用熒光顯微鏡檢測細(xì)胞TMRM熒光值。
　　8.T98G細(xì)胞和胎鼠神經(jīng)元內(nèi)活性氧(ROS)的檢測
　　將TNFα作用于T98G細(xì)胞3h，ANT1敲低質(zhì)粒pSiANT1轉(zhuǎn)染入T98G細(xì)胞72h，A

24、NT1敲低慢病毒LV-SiANT1感染胎鼠神經(jīng)元72h后，加入DCFH-DA(5μM)37℃作用20min，PBS沖洗后收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測熒光值;加入DHE(5μM)37℃作用30min，PBS沖洗后收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測熒光值。
　　研究結(jié)果:
　　1.WB結(jié)果顯示，pSiANT1和LV-SiANT1都可以使T98G細(xì)胞和胎鼠神經(jīng)元內(nèi)源性ANT1的蛋白表達(dá)降低到50％以下。
　　2.WB顯示，加入TNFα

25、后T98G在0，90，180，360min內(nèi)cleaved-caspase3的量無明顯變化，提示此時(shí)TNFα不影響細(xì)胞的凋亡。
　　3.ATP-ADP交換率實(shí)驗(yàn)顯示，T98G細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)ANT1后ATP-ADP交換率較對照升高;而敲低ANT1的T98G的交換率較對照組降低;加入TNFα后ATP-ADP交換率也相應(yīng)降低，提示TNFα可以通過降低ANT1的表達(dá)降低ATP-ADP交換率。
　　4.與對照組相比，加入TNFα和敲低A

26、NT1后，T98G細(xì)胞內(nèi)的ATP量降低;加入TNFα和敲低ANT1的胎鼠神經(jīng)元內(nèi)ATP含量也降低，提示TNFα可以通過降低ANT1的表達(dá)降低細(xì)胞內(nèi)ATP的量。
　　5.線粒體mPTP孔開放的檢測結(jié)果表示，在T98G細(xì)胞和胎鼠神經(jīng)元中，敲低ANT1和加入TNFα后mPTP孔的開放程度均較對照組降低，提示TNFα可以通過降低ANT1的表達(dá)降低mPTP孔的開放。
　　6.Ca2+介導(dǎo)的線粒體腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在T98G細(xì)胞里，加入

27、TNFα和敲低ANT1的表達(dá)后，線粒體的腫脹程度較對照組降低，結(jié)果提示TNFα可以通過降低ANT1的表達(dá)降低線粒體的腫脹程度。
　　7.線粒體膜電位檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，在T98G細(xì)胞和胎鼠神經(jīng)元中，敲低ANT1和加入TNFα后線粒體的膜電位都相應(yīng)增加，因此提示TNFα可以通過降低ANT1的表達(dá)增加細(xì)胞線粒體的膜電位。
　　8.檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧的流式結(jié)果顯示，在T98G細(xì)胞和胎鼠神經(jīng)元中，敲低ANT1和加入TNFα后細(xì)

28、胞內(nèi)活性氧的量都較對照組有所升高，提示TNFα可以通過降低ANT1的表達(dá)增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的量。
　　9.統(tǒng)計(jì)分析
　　應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用t檢驗(yàn)和one-way ANOVA檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析;P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.NF-κB信號通路的激活可以降低線粒體ATP-ADP交換率。
　　2.NF-κB信號通路的激活可以降低細(xì)胞內(nèi)ATP的量。
　　3.NF