一氧化氮對(duì)肥城桃果實(shí)線粒體腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶的調(diào)控機(jī)理.pdf

1、腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶（adenine nucleotide translocator，ANT）是線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的重要組成部分，參與調(diào)控MPTP的生理功能，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但其在植物體中發(fā)揮的作用機(jī)理并不明確。一氧化氮（nitric oxide，NO）作為氣體分子，以其脂溶性的特點(diǎn)是三大生命信息傳遞信使中第一信使的一員，在植物體中介導(dǎo)多

2、種生理功能，參與調(diào)控線粒體的生理功能，參與植物幼苗的生長(zhǎng)、果實(shí)的成熟等過(guò)程；而適當(dāng)濃度的外源 NO能延長(zhǎng)果實(shí)的儲(chǔ)存時(shí)間。所以，探明NO對(duì)ANT蛋白的作用及其調(diào)控機(jī)理有助于明確ANT蛋白對(duì)肥城桃桃果實(shí)采后保鮮的影響，對(duì)優(yōu)化延長(zhǎng)桃果實(shí)儲(chǔ)存時(shí)間的方法有重要意義。
　　本論文中的實(shí)驗(yàn)均以肥城桃桃果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料。從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）

3、獲取已知的玉米、水稻等ANT基因的mRNA序列，通過(guò)比對(duì)得到ANT的保守區(qū)序列，以該保守區(qū)序列設(shè)計(jì)兼并引物，從肥城桃桃果實(shí)提取出總 RNA并克隆獲得 cDNA。使用RACE技術(shù)，以克隆獲得的cDNA為模板，得到ANT基因的cDNA序列全長(zhǎng)1432 bp，編碼區(qū)1155 bp，共編碼384個(gè)氨基酸。經(jīng)模擬分析，ANT發(fā)生谷胱甘肽化反應(yīng)比發(fā)生亞硝基化反應(yīng)更容易進(jìn)行，NO與ANT蛋白有且僅有一種可能發(fā)生相互作用。構(gòu)建ANT-pET30a重組載

4、體，導(dǎo)入大腸桿菌Transetta(DE3)進(jìn)行蛋白表達(dá)，使用鎳柱純化目的蛋白，再經(jīng)過(guò)透析復(fù)性，超濾管過(guò)濾濃縮，得到純化復(fù)性后的ANT蛋白。
　　利用酵母雙雜交技術(shù)檢驗(yàn)ANT蛋白和PiC蛋白之間是否能相互作用，結(jié)果顯示菌株能夠正常生長(zhǎng)并且顯現(xiàn)藍(lán)色，表明兩者可以相互作用。從 NO與純化復(fù)性后的ANT蛋白作用的熒光光譜中發(fā)現(xiàn)，NO可以使ANT蛋白發(fā)生熒光猝滅的現(xiàn)象，且屬于靜態(tài)猝滅。通過(guò)Scatchard模型分析得到，NO與ANT以2:

5、1的結(jié)合形式相互作用形成復(fù)合物。從ANT實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究中發(fā)現(xiàn)，15μmol L-1 NO處理降低了ANT的表達(dá)量。外源NO對(duì)肥城桃桃果實(shí)線粒體的生理生化指標(biāo)的研究結(jié)果表明：經(jīng)15μmol L-1 NO處理的桃果實(shí)線粒體中ROS含量明顯的下降，同時(shí)增強(qiáng)了SOD、POD、CAT等抗氧化酶的活性，降低了線粒體中MDA的含量，減少了線粒體呼吸的耗氧量，進(jìn)而降低細(xì)胞的呼吸作用。而經(jīng)c-PTIO處理的得桃果實(shí)線粒體中ROS含量顯著提高，同時(shí)

6、也減弱了SOD、POD、CAT等抗氧化酶的活性，MDA的含量也明顯升高，增加了線粒體的耗氧量。隨桃果實(shí)儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，線粒體膜電勢(shì)整體呈下降的趨勢(shì)，而15μmol L-1 NO處理有效的減緩了線粒體膜電勢(shì)的降低速率。80 mmol L-1 NAC-15μmol L-1 NO協(xié)同處理可以使線粒體中ROS、MDA含量顯著降低，提高 SOD的活性，減緩線粒體膜電勢(shì)的降低，降低線粒體的耗氧量。結(jié)果表明外源NO通過(guò)調(diào)控線粒體的各項(xiàng)生理功能，達(dá)到延