一氧化氮對桃果實三羧酸循環(huán)相關酶活性及蛋白質結構的影響.pdf

1、本實驗研究了NO對采后肥城桃果實線粒體三羧酸循環(huán)相關酶活性的影響。在4℃條件下，用0、5、15和30μL L-1的NO分別處理6、12、18、24、30天，檢測不同NO濃度和時間處理條件下丙酮酸脫氫酶系和三羧酸循環(huán)中一系列相關酶活性的影響。結果表明在整個處理期間，三種不同濃度的NO處理均可以促進丙酮酸脫氫酶系和延胡索酸酶活性，5和15μL L-1NO處理的檸檬酸合酶活性較對照有輕微提高。30μL L-1 NO處理則很明顯地抑制了琥珀硫激

2、酶和琥珀酸脫氫酶的酶活性。15μL L-1 NO處理12天后可以促進對順烏頭酸酶、α-酮戊二酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶酶活性，但是在前12天不同濃度NO抑制了順烏頭酸酶活性。15和30μL L-1 NO處理6天后，可以使異檸檬酸脫氫酶活性顯著升高，并且在第12和24天后迅速降低。實驗結果表明，不同NO處理濃度和時間對三羧酸循環(huán)相關酶的活性有不同影響。
　　 另外，用毛細管電泳檢測有機酸含量表明，30和5μL L-1 NO處理分別在第

3、18和24天琥珀酸含量有顯著的積累。實驗表明，NO可與線粒體中多種酶發(fā)生作用，通過抑制琥珀硫激酶和琥珀酸脫氫酶活性控制三羧酸循環(huán)，并且NO對琥珀酸脫氫酶活性抑制作用大于對琥珀硫激酶活性的抑制，造成琥珀酸的積累。
　　 線粒體蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶是三羧酸循環(huán)中按順序相連的兩個酶，本實驗應用表面等離子共振技術和聚乙二醇沉淀法檢測mMDH和CS在中的相互作用。采用共價鍵偶聯(lián)法使11-巰基十一烷酸末端巰基與金膜形成牢固的Au-S鍵，

4、將mMDH結合在芯片上，然后在線檢測mMDH和CS的結合情況。結果表明SPR可以檢測到mMDH和CS發(fā)生相互作用，并且，NO處理后可以使相互作用加強。
　　 用80 mmol L-1 NO處理mMDH、CS和mMDH+CS復合物的酶活性，檢測結果表明，NO對mMDH活性沒有顯著的影響;對CS的活性有顯著的促進作用，為對照組的3.4倍;由于mMDH和CS催化三羧酸循環(huán)中的連續(xù)反應，對mMDH+CS復合物活性也有明顯的促進作用，為對

5、照組的1.25倍。推測出NO可以增強mMDH和CS的相互作用。由于酶之間的結合形成草酰乙酸(OAA)的通路，這個通路的存在使中間產物可以很容易的通過兩個酶，這樣mMDH產生的產物就可以直接作為底物提供給CS，對新陳代謝的直接轉換有重要作用。
　　 圓二色譜結果表明，NO明顯改變了CS和mMDH的二級結構。計算機模擬圖直觀的顯示了NO對mMDH和CS影響，可看出NO和CS的活性中心的Asn242形成共價鍵，存在較強的相互作用力;而