γ-氨基丁酸對情緒應(yīng)激大鼠額葉皮質(zhì)一氧化氮合酶和一氧化氮水平的影響

1、<p>　　γ-氨基丁酸對情緒應(yīng)激大鼠額葉皮質(zhì)一氧化氮合酶和一氧化氮水平的影響</p><p>　　歐陽俊彥，胡卓炎，褚玥，梁添，賴玉婷，羿利華，柳春紅（510642 廣州，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室）</p><p>　　[摘要] 目的 觀察γ-氨基丁酸（GABA）對情緒應(yīng)激大鼠一氧化氮合酶（NOS）和一氧化氮（NO）含量的影響，結(jié)合行為學(xué)實驗，探討

2、γ-氨基丁酸抗焦慮作用機(jī)理。方法 將40只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠隨機(jī)分為五個組：定時飲水組（C）、情緒應(yīng)激組（E）、0.5 mg/kg GABA劑量組（L）、1 mg/kg GABA劑量組（M）和2 mg/kg GABA劑量組（H），采用不確定性空瓶刺激的方法建立焦慮大鼠模型，并在應(yīng)激前分別給予大鼠灌服生理鹽水或相應(yīng)劑量的GABA，14 d后進(jìn)行曠場實驗并分析各組大鼠額葉皮質(zhì)一氧化氮合酶和一氧化氮水平的差異。結(jié)果

3、 應(yīng)激14 d后C組與其余各組的食物利用率差異極顯著（P＜0.01）；各組大鼠在中央?yún)^(qū)域的停留時間差異極為顯著（p＜0.01）；C組、M組和H組進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)顯著高于E組（P＜0.05）；E組的修飾次數(shù)顯著高于M組和H組（P＜0.05）；總運動距離和直立次數(shù)均無顯著性差異（P＞0.05）；對大鼠額葉皮質(zhì)NOS及NO的分析顯示C組和H組的NOS活力及NO含量顯著高于E組（P＜0.05）。結(jié)論 GABA與焦慮大鼠額葉皮</p&

4、gt;<p>　　關(guān)鍵詞：γ-氨基丁酸；焦慮；一氧化氮合酶；一氧化氮；曠場實驗</p><p>　　[中圖分類號] R749.4 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A </p><p>　　Modulation of emotional stress-induced NOS and NO changes in frontal cortex by 4-aminobutyric acid i

5、n rats</p><p>　　OuYang Junyan, Hu Zhuoyan, Chu Yue, Liang Tian, Lai Yuting, Yi Lihua, Liu Chunhong（College of Food Science，South China Agricultural University，The Key Laboratory of Food Quality and Safety，Gu

6、angzhou，510642，China）</p><p>　　[Abstract] Objective To observe the effect of 4-aminobutyric acid(GABA) on NOS activity and NO levels combining behavioral test of rats exposed to emotional stress, and explo

7、re its anti-anxiety mechanisms. Method Utilizing the rat model of emotional stress induced by empty water bottles, 40 male Sprague-Dawley rats were divided into 5 groups randomly(n=8 each), control group(C), emotional s

8、tress group(E), 0.5 mg/kg GABA group(L), 1 mg/kg GABA group(M) and 2 mg/kg GABA group(H). Rats were pret</p><p>　　[Keywords] 4-aminobutyric acid; anxiety; NOS; NO; open field test</p><p>　　Supp

9、orted by the earmarked fund for Modern Agro-industry Technology Research System（CARS-33). Corresponding author: Liu Chunhong, E-mail: liuch@scau.edu.cn</p><p>　　[基金項目] 國家荔枝龍眼產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-33)</p><p&

10、gt;　　[通訊作者] 柳春紅，Email: liuch@scau.edu.cn</p><p>　　γ-氨基丁酸 (γ-Aminobutyric acid，GABA)又稱γ-氨酪酸，作為一種非蛋白質(zhì)天然氨基酸，廣泛分布在動物、植物和微生物體中，是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、改善腎功能和鎮(zhèn)靜等生理作用[1]。</p><p>　　NO在神經(jīng)系統(tǒng)中起著信

11、使分子的作用，廣泛參加了生物體內(nèi)的各種病理和生理過程[2]，它與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中各種神經(jīng)遞質(zhì)之間的關(guān)系也越來越受關(guān)注。近年來的研究發(fā)現(xiàn)NO與焦慮密切相關(guān)，但結(jié)果并不一致[3-5]。此外，目前大部分的研究都集中在急性應(yīng)激模型中，慢性應(yīng)激模型中也往往采用包含軀體應(yīng)激成分的模型如束縛應(yīng)激、條件性電擊及慢性溫和應(yīng)激（CMS）等[6-8]，不能很好地模擬人類由情緒應(yīng)激引起的焦慮癥狀，而有關(guān)GABA與NO之間的關(guān)系與機(jī)制研究國內(nèi)更是少見報道。在中樞神

12、經(jīng)系統(tǒng)中，額葉皮質(zhì)是與情緒密切相關(guān)的重要區(qū)域，所以本研究通過建立不確定性空瓶刺激模型，結(jié)合大鼠額葉皮質(zhì)NO的變化，探討GABA對慢性情緒應(yīng)激大鼠的抗焦慮作用機(jī)制。</p><p><b>　　1 材料和方法</b></p><p><b>　　1.1 實驗動物</b></p><p>　　健康雄性 Sprague-Da

13、wley 大鼠40只，體重 150~170 g。動物及其飼料均購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK（粵）2008-0002。大鼠單籠喂養(yǎng)，在實驗室適應(yīng)7天，光/暗周期為12h/12h(光照時間為07：00~19：00)，室內(nèi)溫度為(22±0.5℃)，濕度為50%左右。適應(yīng)期內(nèi)所有動物自由攝食和飲水。 </p><p>　　1.2 實驗試劑及設(shè)備</p><p>

14、;　　GABA（純度＞99%）購自上海晶純實業(yè)有限公司；一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）及考馬斯亮藍(lán)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。所用儀器包括：動物行為軌跡跟蹤系統(tǒng)EthoVision XT 8.0（荷蘭Noldus公司）；手動勻漿器；Eppendorf 5417R小型臺式高速離心機(jī)；HH-W21-600型電熱恒溫水溫箱；METTLER TOLEDO EL2001電子天平；日立U3010型紫外分光光度儀。</p>

15、;<p><b>　　1.3 實驗程序</b></p><p>　　大鼠適應(yīng)一周后按照體重編號隨機(jī)分為五組：定時飲水組（C），情緒應(yīng)激組(E)，0.5 mg/kg GABA劑量組（L）、1 mg/kg GABA劑量組（M）和2 mg/kg GABA劑量組（H）。分別對五組動物進(jìn)行定時喂水訓(xùn)練7天，定時喂水訓(xùn)練為每日2次，即每天早上9：00~9：10和晚上9：00~9：10給動

16、物飲水，之后撤掉水瓶，其余時間不給水。每天定時喂水1 h前，C組和E組給予大鼠灌服生理鹽水，各個GABA劑量組則灌服對應(yīng)劑量的GABA溶液。定時喂水期結(jié)束后開始應(yīng)激實驗，情緒應(yīng)激組在定時喂水時間內(nèi)給予空瓶刺激誘發(fā)其情緒應(yīng)激，刺激是早上9：00~9：10或晚上9：00~9：10隨機(jī)給予的，維持一天一次；各個GABA劑量組與情緒應(yīng)激組相仿；定時飲水組動物一直定時飲水，應(yīng)激共持續(xù)14天。所有動物在適應(yīng)期末和應(yīng)激期末測量體重及進(jìn)食量，計算食物利

17、用率，食物利用率為每消耗100 g飼料所增加的體重克數(shù)。行為學(xué)測試前一周所有動物每天接受3 min撫摸以減少無關(guān)刺激，應(yīng)激結(jié)束后進(jìn)行曠場行為學(xué)測定。</p><p>　　1.4 曠場實驗（Open field test）</p><p>　　實驗裝置為高50 cm、底邊長50 cm的無蓋方箱，中央畫有長×寬為30 cm×30 cm的方格，方格內(nèi)所包含的區(qū)域為中央?yún)^(qū)域，

18、沿墻格的為外周區(qū)域。實驗動物均提前1 h進(jìn)入測試實驗室以適應(yīng)環(huán)境。行為學(xué)實驗室保持安靜通風(fēng)，曠場分析箱上方掛一40W的白熾燈并保持恒亮，室溫22℃。將大鼠置于方形曠場的外周區(qū)域，通過曠場上方的攝像機(jī)及與隔壁相連的監(jiān)視器和錄像機(jī)觀察5 min內(nèi)大鼠的活動情況。分別記錄大鼠在曠場中央?yún)^(qū)域的停留時間、進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)、總運動距離、直立次數(shù)（后肢站立）以及修飾次數(shù)（梳理皮毛和洗臉）。每次觀察完成后將動物排泄物清除干凈，并用75%的酒精徹底清洗

19、曠場并擦干。</p><p>　　1.5 NO及NOS的測定</p><p>　　行為學(xué)測試完畢后，各組大鼠斷頭取腦，在冰面上分離大腦額葉皮層，置于-80℃冰箱中待測。使用前用預(yù)冷的生理鹽水沖洗腦組織以去除血跡，濾紙拭干，分析天平稱重，用生理鹽水在冰浴中制成10%的勻漿，冷凍離心機(jī)500 g4℃下離心10 min，取上清液待測。NO的檢測采用硝酸還原酶法，利用硝酸還原酶特異性將硝酸根還原

20、為亞硝酸根，通過顯色深淺測定其濃度。NOS能催化L-精氨酸（L-Arg）和分子氧生成NO，NO與親核性物質(zhì)生成有色化合物，根據(jù)吸光度大小可確定NOS活力。樣品的蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)法測定。</p><p>　　1.6 統(tǒng)計學(xué)處理方法</p><p>　　采用SAS 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD）表示，單因素方差分析（one w

21、ay analysis of variance, ANOVA）進(jìn)行處理，以p＜0.05為差異顯著，進(jìn)一步post-hoc分析兩組間差異采用Student-Newman-Keuls檢驗（SNK法），p＜0.05為差異顯著。</p><p><b>　　2 實驗結(jié)果</b></p><p><b>　　2.1 體重變化</b></p>

22、<p>　　建模前后五組動物的體重增長量總體比較差異極為顯著（P＜0.01），C組體重增加顯著高于其余各組（P＜0.01）；各組大鼠的進(jìn)食量比較差異顯著（P＜0.05），E組的進(jìn)食量顯著低于其余各組（P＜0.01）；各組大鼠的食物利用率總體比較差異極顯著（P＜0.01），C組的食物利用率高于其余各組（P＜0.01），食物利用率隨著GABA劑量的增加而有所下降。結(jié)果見表1。</p><p>　　表1

23、 建模前后各組大鼠體重的差異比較（g，M±SD，n=8）</p><p>　　注：a表示與C組比較，P＜0.01</p><p>　　2.2 曠場行為的變化</p><p>　　建模后E組較C組在中央?yún)^(qū)域的停留時間明顯減少，與M組，H組差異極為顯著（P＜0.01），隨著GABA劑量的增加，動物在中央?yún)^(qū)域的停留時間相應(yīng)增加。同時，E組較C組進(jìn)入中央?yún)^(qū)域次數(shù)

24、也明顯減少，與M組，H組差異顯著（P＜0.05），隨著GABA劑量的增加，動物進(jìn)入中央?yún)^(qū)域次數(shù)亦相應(yīng)增加。各組動物的總運動距離和直立次數(shù)均沒有顯著差異（P＞0.05）。E組的修飾次數(shù)顯著高于M組和H組（P＜0.01），隨GABA劑量的遞增動物的修飾次數(shù)呈下降趨勢。結(jié)果見表2。</p><p>　　表2 建模后各組大鼠曠場行為指標(biāo)的差異比較（M±SD，n=8）</p><p>　

25、　注：a表示與E組比較，P＜0.05；b表示與E組比較，P＜0.01</p><p>　　2.3 NOS及NO含量的變化</p><p>　　建模后各組大鼠間額葉皮質(zhì)NOS活力差異顯著（P＜0.05），進(jìn)一步用SNK法進(jìn)行多重比較，結(jié)果顯示E組的NOS活力顯著低于C組和H組（P＜0.05）；各組大鼠之間NO含量差異顯著（P＜0.05），進(jìn)一步的多重比較顯示E組的NO含量顯著低于C組和H組

26、（P＜0.05）。隨著GABA劑量的增加大鼠的NOS活力和NO含量均呈上升趨勢，結(jié)果見圖1，圖2。</p><p>　　圖1 各組大鼠額葉皮質(zhì)的NOS活力 圖2 各組大鼠額葉皮質(zhì)的NO濃度</p><p>　　注：a表示與E組比較，P＜0.05</p><p><b>　　3 討論</b>

27、</p><p>　　本研究采用不確定性空瓶刺激建立慢性應(yīng)激焦慮大鼠模型，此模型能夠誘發(fā)動物攻擊、咬瓶子、頻繁修飾等焦慮行為。以往大多數(shù)研究所采用的應(yīng)激源都摻雜了生理因素的影響，而此應(yīng)激模型不含電擊等物理應(yīng)激成分，因此，能很好地模擬人類在單純情緒應(yīng)激下的焦慮行為和生理反應(yīng)[9]。曠場實驗是經(jīng)典的焦慮動物模型，其原理是利用了動物對新異環(huán)境的恐懼心理和探究特性形成的矛盾沖突來考察動物的焦慮狀態(tài)。周邊區(qū)域?qū)游飦碚f相對

28、安全，而探究的天性又促使其進(jìn)入中央?yún)^(qū)域活動，因此，焦慮水平高的動物傾向于停留在周邊區(qū)域，反之，中央?yún)^(qū)域的探究次數(shù)和時間越多，焦慮水平則越低[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，情緒應(yīng)激組的大鼠在中央?yún)^(qū)域的停留時間及進(jìn)入次數(shù)顯著下降，表現(xiàn)出明顯的焦慮癥狀，提示造模成功。</p><p>　　GABA是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在大腦皮質(zhì)、丘腦、海馬等多個部位發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，焦慮癥與GABA能神經(jīng)系統(tǒng)功能的失調(diào)密

29、切相關(guān)。一般認(rèn)為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的GABA作用于GABAA受體，通過改變神經(jīng)細(xì)胞膜的氯離子的通透性達(dá)到抑制突觸后電位，從而抑制焦慮狀態(tài)下的神經(jīng)細(xì)胞活性的作用[13]。然而，由于外源性GABA對血腦屏障的透過率很低[14]，口服GABA的抗焦慮效果一直存有疑問。周春英等人的研究顯示GABA能改善慢性應(yīng)激抑郁大鼠的認(rèn)知功能[15]；KANEHIRA等人研究發(fā)現(xiàn)給予健康受試者服用含50 mg GABA的飲料250 ml，能有效減輕受試者的身心疲

30、勞并提高其完成任務(wù)的效率，但其作用機(jī)制并不明確[16]。本實驗中給予應(yīng)激大鼠服用GABA后，三個劑量組都在沒有改變大鼠活動性的前提下不同程度地增加了動物的中央?yún)^(qū)域停留時間及進(jìn)入次數(shù)，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，提示GABA在此模型上具有抗焦慮作用。此外，直立次數(shù)與修飾次數(shù)作為曠場行為的指標(biāo)，同樣能反映動物的情緒狀態(tài)，直立行為的減少與頻繁的修飾行為，往往暗示焦慮水平更高[17, 18]。M組和H組大鼠的修飾行為較E組顯著下降，提示</p&g

31、t;<p>　　以往的研究表明，海馬和前腦是應(yīng)激所涉及的關(guān)鍵腦區(qū)。海馬雖然對應(yīng)激很敏感，但同時也具有較強(qiáng)的修復(fù)能力，而前腦在應(yīng)激時的代償能力較差，也有研究證明，額葉皮質(zhì)與情緒的關(guān)系密切[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性情緒應(yīng)激組的NOS活力及NO含量顯著下降，與定時飲水組及GABA 2 mg/kg組差異顯著，這與Masood[23]等的研究結(jié)果一致。NO是一種廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的氣體分子，是信號傳導(dǎo)和神經(jīng)傳遞的重要信使。NOS

32、作為NO的合成酶，主要分布在與焦慮緊密相關(guān)的腦區(qū)如海馬、額葉和下丘腦等。有研究顯示，給予大鼠注射不同劑量的L-精氨酸（一氧化氮合酶抑制劑），大鼠在明暗穿箱實驗及孔板實驗中表現(xiàn)出不同程度的焦慮[24]，由此推測NO水平的下降與焦慮的發(fā)生相關(guān)聯(lián)。本實驗中，隨著GABA灌胃劑量的上升，NOS活力及NO含量相應(yīng)增加，呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，提示GABA可能通過上調(diào)NO水平發(fā)揮其抗焦慮作用。Gilhotra[25]等人的研究表明焦慮大鼠腦中的GABA含

33、量顯著下降，而GABA和地西泮均能提高腦中NO的含量，相對地，NO水平的上升同樣能增加GABA的含量[26]。目前已有研究顯示在大鼠蒼白球中NO能拮抗</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] Lee B, Kim J, Kang Y M, et al. Antioxidant activity and γ-aminobutyric a

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