激活NF-κB信號(hào)通路的TGEV蛋白篩選及功能域確定.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(Swine transmissible gastroenteritis，TGE)病原為豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)，臨床上以發(fā)熱、嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水和2周齡以內(nèi)仔豬高死亡率為特征。目前，該病在多個(gè)國(guó)家均有報(bào)道，已成為大型養(yǎng)豬場(chǎng)仔豬腹瀉性死亡的主要原因之一，極大地限制了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。已有研究表明，TGEV感染可導(dǎo)致小腸上皮嚴(yán)重

2、病變，空腸回腸絨毛嚴(yán)重萎縮，同時(shí)可以促進(jìn)腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-α等大量的炎癥因子。由此可見(jiàn)，TGEV感染機(jī)體后誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)可能與其致病機(jī)制密切相關(guān)。NF-κB(Nuclear factor-kappa B)是一類(lèi)在促炎癥基因表達(dá)過(guò)程中起到關(guān)鍵作用的核蛋白因子，具有多重轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，在病毒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。有研究表明TGEV感染能激活NF-κB信號(hào)通路，但TGEV誘

3、導(dǎo)炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制尚未確定。因此，本研究以確定TGEV感染細(xì)胞對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用為切入點(diǎn)，篩選TGEV激活NF-κB信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，并進(jìn)一步確定其激活NF-κB信號(hào)通路的關(guān)鍵功能域，以期為闡明TGEV誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)TGEV感染豬睪丸細(xì)胞(Swine testicle，ST)對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響，結(jié)果表明，接種TGEV滴度的升高和TGEV感染

4、時(shí)間的增加均可導(dǎo)致雙熒光素酶活性比值的顯著升高，而紫外滅活的TGEV同對(duì)照組相比沒(méi)有明顯的變化;間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(Indirect immunofluorescence assay，IFA)結(jié)果表明，TGEV感染可以促進(jìn)p65發(fā)生核轉(zhuǎn)移。以上研究結(jié)果表明TGEV可以顯著激活NF-κB信號(hào)通路并且其激活作用與TGEV的滴度和復(fù)制密切相關(guān)。
　　為了進(jìn)一步確定激活NF-κB信號(hào)通路的TGEV的關(guān)鍵蛋白，本研究通過(guò)RT-PCR的方法擴(kuò)增

5、了TH-98株TGEV的Nsp1、Nsp2、Nsp3、Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp7 Nsp8、 Nsp9、Nsp10、Nsp11+Nsp12、Nsp13、Nsp14、Nsp15、Nsp16、S基因、ORF3a、ORF3b、E基因、M基因、N基因、ORF7各基因片段并構(gòu)建各段基因的真核表達(dá)載體，Western Blot和IFA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明TGEV各蛋白均在細(xì)胞中成功表達(dá)。利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)TGEV各個(gè)蛋白對(duì)NF-κB信號(hào)

6、通路有影響，結(jié)果表明Nsp1、Nsp2、Nsp3、Nsp6、Nsp14、ORF7均可激活NF-κB信號(hào)通路，其中，Nsp2的激活作用最為顯著。利用Western Blot和IFA檢測(cè)Nsp2對(duì)NF-κB信號(hào)通路經(jīng)典途徑中的關(guān)鍵因子IκBα、p65的影響，結(jié)果表明Nsp2可促進(jìn)IκBα的降解及p65的磷酸化、核轉(zhuǎn)移，由此可見(jiàn)，Nsp2可通過(guò)經(jīng)典途徑激活NF-κB信號(hào)通路。
　　為確定TGEV Nsp2激活NF-κB信號(hào)通路的關(guān)鍵序列

7、，本研究通過(guò)構(gòu)建包含TGEV Nsp2各個(gè)關(guān)鍵功能域的基因片段的真核表達(dá)載體，利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)確定Nsp21-120位氨基酸是激活NF-κB信號(hào)通路的關(guān)鍵序列。
　　綜上所述，本研究證實(shí)了TGEV感染可以顯著激活NF-κB信號(hào)通路，并且其激活作用與TGEV的滴度和復(fù)制密切相關(guān);TGEV Nsp2激活NF-κB信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，其可通過(guò)誘導(dǎo)IκBα的降解、p65的磷酸化和核轉(zhuǎn)移來(lái)激活NF-κB信號(hào)通路;其中，1-120位氨基酸