當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)Ox-LDL激活NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用研究.pdf

1、目的：巨噬細(xì)胞吞噬大量氧化低密度脂蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，是動(dòng)脈粥樣硬化形成的早期關(guān)鍵病理變化。核轉(zhuǎn)錄因子-к B(NF-к B)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的調(diào)控作用。本課題通過研究當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NF-к B表達(dá)的影響，探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)制。 方法： 1．制備當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清、氧化低密度脂蛋白；臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞活性；

2、MTT法檢測(cè)兔含藥血清、無藥血清對(duì)細(xì)胞存活率的影響。 2．免疫組化法檢測(cè)NF-к Bp65的表達(dá)。 3．免疫印跡法檢測(cè)NF-к Bp65的蛋白活性變化。 4．實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)NF-к Bp65mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 1．細(xì)胞培養(yǎng)3～4h后開始貼壁生長(zhǎng)，2～3天后，細(xì)胞匯合成單層。臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞活力>95％，可用于實(shí)驗(yàn)。兔含藥血清、無藥血清對(duì)細(xì)胞有營養(yǎng)作用促進(jìn)其生長(zhǎng)，但濃度過高會(huì)產(chǎn)生一定的

3、細(xì)胞毒作用，在各劑量組中10％濃度對(duì)細(xì)胞影響較小。 2．免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示：陽性染色物為棕黃色顆粒，位于胞漿或胞核中。陽性對(duì)照組(Ox-LDL，組)細(xì)胞漿或核內(nèi)可見大量棕黃色顆粒，陰性對(duì)照組中細(xì)胞漿或核內(nèi)均無表達(dá)，空白對(duì)照組中棕黃色顆粒較少，這些結(jié)果說明用100μg/mlOx-LDL刺激RAW264.7細(xì)胞4h后，NF-к Bp65表達(dá)明顯增強(qiáng)。PAR組細(xì)胞中棕黃色顆粒較少，說明PAR可明顯抑制NF-к Bp65的表達(dá)。在三個(gè)

4、含藥血清劑量組中，高劑量組細(xì)胞中棕黃色顆粒最少，且比Ox-LDL組少，說明當(dāng)歸補(bǔ)血湯可下調(diào)經(jīng)Ox-LDL刺激后RAW264.7細(xì)胞中NF-к Bp65的表達(dá)量，以高劑量含藥血清作用最明顯，因此，在三個(gè)劑量組中選擇高劑量含藥血清組進(jìn)行之后的實(shí)驗(yàn)。 3．免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示：Ox-LDL組蛋白條帶灰度比值為1.2883±0.0139，與空白對(duì)照組(0.5894±0.0117)比較差異有顯著性意義(P<0.01)，說明Ox-LDL刺激

5、RAW264.7細(xì)胞后NF-к Bp65蛋白活性明顯增強(qiáng)；抑制劑PAR組(0.7713±0.0211)與Ox-LDL組比較差異顯著(P<0.01)，說明PAR對(duì)NF-кBp65蛋白活性有明顯的抑制作用；含藥血清組(0.9189±0.0153)，與Ox-LDL組比較有差異(P<0.05)，說明當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清能下調(diào)NF-к Bp65的蛋白活性。 4．實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：Ox-LDL組mRNA表達(dá)量(0.007870±

6、0.0024918)，與空白對(duì)照組(0.0026374-0.0014726)比較有顯著差異(P<0.05)，說明Ox-LDL刺激RAW264.7細(xì)胞后NF-к Bp65mRNA表達(dá)增強(qiáng)。PAR組(0.004706±0.0010521)、含藥血清組(0.0053354-0.0009869)分別與Ox-LDL組比較均有顯著差異(P<0.05)。說明PAR對(duì)NF-к Bp65的mRNA表達(dá)有明顯抑制作用，當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清能下調(diào)NF-к Bp

7、65mRNA的表達(dá)。 結(jié)論：100μg/ml的Ox-LDL刺激RAW264.7細(xì)胞4h后，能明顯激活NF-к B通路，增強(qiáng)NF-к Bp65的蛋白活性，提高NF-к Bp65的基因表達(dá)；PAR對(duì)NF-к Bp65活化具有明顯抑制作用；當(dāng)歸補(bǔ)血湯一定程度上能減少NF-к Bp65的活化量，下調(diào)其基因表達(dá)。推測(cè)當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能通過調(diào)節(jié)該通路以調(diào)控相關(guān)致炎因子的表達(dá)進(jìn)而影響As的發(fā)生發(fā)展，阻斷NF-к B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是當(dāng)歸補(bǔ)血湯抗A