硝酸鎵對大鼠成骨細(xì)胞及去卵巢大鼠OPG-RANKL表達(dá)的影響.pdf

1、背景:
　　鎵是否是生命必須元素尚待探討，但據(jù)研究，鎵鹽制劑具有抗癌和固鈣強(qiáng)骨作用，因而，鎵在醫(yī)藥臨床領(lǐng)域倍受關(guān)注。離子鎵在醫(yī)學(xué)研究中的進(jìn)展:離子鎵具有抗癌作用;離子鎵能夠降低血清鈣磷，可以減少患者的骨流失率;離子鎵可以增加去卵巢大鼠的骨面積，骨痂及骨小梁結(jié)構(gòu)性能，減少破骨細(xì)胞數(shù)，加速骨折骨痂愈合，同時也可以增加這些動物的生物力學(xué)強(qiáng)度。世界衛(wèi)生組織(WHO)將骨質(zhì)疏松定義為:以低骨質(zhì)量，骨組織微觀結(jié)構(gòu)破壞為特征，并且容易發(fā)生脆性骨

2、折的骨骼系統(tǒng)疾病。成骨細(xì)胞是調(diào)節(jié)骨重建的重要細(xì)胞。成骨細(xì)胞分泌RANKL以激活破骨細(xì)胞的分化及成熟的同時，成骨細(xì)胞還會分泌一種叫做骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)的因子以保護(hù)骨骼。成骨細(xì)胞分泌的與RANKL競爭的可溶性分子OPG競爭結(jié)合RANK而抑制破骨細(xì)胞分化及其功能。因此OPG與RANKL之間的平衡在骨代謝的過程中起著重要作用。
　　目的:
　　離子鎵可以通過影響成骨細(xì)胞前體分泌破骨細(xì)胞分化因子，通過O

3、PG/RANKL/RANK系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的生成，從而影響骨重塑過程。本研究的主要目標(biāo)是通過體內(nèi)及體外實驗觀察在GaN是否能降低RANKL而升高OPG的表達(dá)。
　　方法:
　　8-10周齡SPF級雌性SD大鼠45只，體質(zhì)量約180-200g，中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。按清潔級實驗動物管理標(biāo)準(zhǔn)，室溫恒定25℃濕度恒定48％，光照/黑暗時間為13/11小時，各組大鼠均單籠喂養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)（含鈣1.19％，磷0.85％，維

4、生素D），自由攝食、飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)入實驗期。把大鼠45只隨機(jī)平均分成3組:即(1)假手術(shù)組:(2)去卵巢組;(3)去卵巢+鎵治療組(120μg/kg/day)。實驗期間分別于造模前、造模后第4周、造模后第8周、GaN干預(yù)第4周及8周時，用2.5mg/100g體重的戊巴比妥鈉腹腔注射后，應(yīng)用雙能X線（dual-energy X-ray absorptiometry，DXA）儀測定其脛骨骨密度值。將新生24小時SD大鼠，剝離頭皮，

5、然后取出大鼠的顏骨，至于0.25％ EDTA-Trypsin消化液中消化30分鐘，然后將骨片至于含0.1％Ⅱ型膠原酶中，消化，離心得到成骨細(xì)胞，種瓶進(jìn)行成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)。血樣的收集、骨標(biāo)本的收集、細(xì)胞上清液收集及細(xì)胞收集后，分裝于相應(yīng)小塑料管中，-80℃冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本收集完成后再分別進(jìn)行骨組織切片骨形態(tài)學(xué)分析，免疫組化分析，RT-PCR，western-blot分析及ELISA分析。
　　結(jié)果:
　　實驗動物造模后第4

6、及8周后，骨密度值分別下降6.5％(P＜0.05)及34.1％(P＜0.05)。然而通過GaN干預(yù)后的OVX+GaN組對比OVX組在第4及8周測量的骨密度值分別上升了19.3％(P＜0.05)及37.3％(P＜0.05)。骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)果，本研究通過用骨量及組織量比值(Bone volume/tissue volume，BV/TV)，骨小梁厚度(Trabecular thickness，Tb.Th)，骨小梁數(shù)量(Trabecular n

7、umber，Tb.N)，及骨小梁間隙(Trabecular separation，Tb.Sp)來表達(dá)。OVX+GaN組的BV/TV值較對照組增加40.9％(P＜0.05)，可以看出GaN可以明顯增加全卵巢大鼠脛骨骨量; OVX+GaN組的Tb.Th值較對照組增加43.3％(P＜0.01);同樣Tb.N值也增加了43.4％(P＜0.05)。而經(jīng)過GaN治療后的全卵巢大鼠的Tb.Sp明顯下降了38.2％(P＜0.01)。為了了解GaN在去卵

8、巢大鼠的OPG及RANKL的影響，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色分析的方法，分別檢測了各組OPG及RANKL的表達(dá)情況。本實驗的結(jié)果顯示GaN可以有效的增加OPG的表達(dá)(P＜0.01)，但是對RANKL表達(dá)的影響不大。本實驗應(yīng)用CCK-8試劑盒來確定GaN對成骨細(xì)胞的最適合濃度，檢測后當(dāng)濃度為10-9 mol/L的時候，成骨細(xì)胞的OD值為最大。為了進(jìn)一步明確GaN對去卵巢大鼠及成骨細(xì)胞OPG及RANKL的作用，本實驗對成骨細(xì)胞細(xì)胞樣本分別進(jìn)行