骨靈片對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠血清OPG-RANKL、PICP和相關(guān)細(xì)胞因子的影響.pdf

1、研究背景： 骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨強(qiáng)度降低，骨脆性增加，易至骨折為主要特征的代謝性骨病。它是一種多發(fā)于中老年人的疾病，它可導(dǎo)致骨強(qiáng)度減弱和骨折發(fā)生率增高，它是引起老年人腰腿痛、脊柱變形及骨折的主要病因。隨著我國(guó)逐漸步入老齡化社會(huì)，患原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(primary osteoporosis，POP)的患者將會(huì)越來越多。研究有效防治OP的藥物和防治方法以及對(duì)其防治機(jī)制的研究是醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)。

2、OP以破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)活化增殖，骨吸收大于骨形成為主要特點(diǎn)，而骨折是OP最危險(xiǎn)的并發(fā)癥。因此任何影響到OC或成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)功能的因素都有可能與OP的發(fā)生有關(guān)，同時(shí)，任何影響到骨骼結(jié)構(gòu)成分的因素也有可能影響到骨強(qiáng)度，改變骨質(zhì)量，導(dǎo)致OP的發(fā)生發(fā)展，它們可改變骨的生物力學(xué)性能，降低骨的柔韌性和強(qiáng)度而導(dǎo)致骨折的發(fā)生。近年來發(fā)現(xiàn)OB表達(dá)的護(hù)骨素(osteoprotegerin，OPG)、護(hù)骨素配體(

3、receptor activator of nuclear factor-KB ligand，RANKL)有調(diào)節(jié)OC的作用，抑制骨吸收。OP的發(fā)生同時(shí)還與眾多細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-6(imerleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfactor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)等的釋放有關(guān)，它們相互作用，共同調(diào)節(jié)著OC與OB的功能。Ⅰ型膠原是人體內(nèi)含量最豐富的膠

4、原類型，它是構(gòu)成骨的重要成分，其結(jié)構(gòu)及數(shù)量改變與OP的發(fā)生、發(fā)展、嚴(yán)重程度密切相關(guān)。Ⅰ型前膠原羧基端前肽(carboxyterminal propeptide oftypeⅠprocollagen，PICP)是OB合成并釋出前膠原纖維的細(xì)胞外分解產(chǎn)物，其在血循環(huán)中的含量主要反映Ⅰ型膠原的合成速率，升高提示Ⅰ型膠原合成速率加快，Ⅰ型膠原合成可增加骨的韌性和強(qiáng)度。中醫(yī)理論認(rèn)為“腎藏精，主骨，生髓”，“髓者，腎精所生，精足則髓足，髓足骨內(nèi)，髓

5、足者則骨強(qiáng)?！蹦I中精氣充盈，則骨髓生化有源，骨才能得到骨髓的滋養(yǎng)，骨骼強(qiáng)壯。若腎中精氣虧虛，骨失所養(yǎng)，骨骼脆弱，則會(huì)導(dǎo)致OP，故治療OP以補(bǔ)腎為主。根據(jù)上述理論，本課題組選用骨碎補(bǔ)、鹿茸等補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨中藥組成了復(fù)方制劑一骨靈丸，在臨床上用于治療OP并取得了顯著的療效。既往研究顯示其可明顯對(duì)抗OP大鼠出現(xiàn)的骨丟失，維護(hù)骨強(qiáng)度，保持骨生物力學(xué)性能，有效防治OP。為了提高療效，我們改良劑型為骨靈片，并進(jìn)一步為中醫(yī)藥的開發(fā)利用及發(fā)展提供理論基

6、礎(chǔ)，本文通過研究骨靈片對(duì)OP動(dòng)物模型血清中OPG、RANKL、PICP以及IL-6、TNF-α、IL-4的變化，進(jìn)一步闡明骨靈片防治OP的機(jī)制。 研究目的： 探討骨靈片對(duì)OP大鼠血清OPG/RANKL及細(xì)胞因子(IL-4、IL-6、TNF-α)以及PICP表達(dá)水平的影響，從分子水平角度闡明骨靈片對(duì)骨代謝以及骨強(qiáng)度的影響，進(jìn)一步闡明骨靈片防治OP的作用機(jī)制。 方法： 1．藥物的制備骨靈片液根據(jù)骨靈片處方(由

7、骨碎補(bǔ)、鹿茸等組成)，采用人服用藥物同批藥材，按骨靈片提取工藝經(jīng)乙醇提取和水提取方法最大效量提取有效成分，過濾濃縮為終濃度為1g生藥/ml，由南方醫(yī)科大學(xué)中藥制劑室提供。 2．實(shí)驗(yàn)分組 取3月齡成熟Sprague dawley(SD)系SPF級(jí)大鼠50只，雌雄各半。將大鼠隨機(jī)分為5組，即正常對(duì)照組(假手術(shù)組，sham-operated group，Control group)、模型組(Model group)、骨靈片(G

8、u Ling Pian，GLP)高劑量組(high dozes group，HDG)、骨靈片中劑量組(middle dozes group，MDG)、骨靈片低劑量組(low dozesgroup，LDG)。3．OP模型的建立采用去勢(shì)法建立大鼠OP模型，即雌性鼠去除卵巢，雄性鼠去除睪丸的手術(shù)方法。 4．喂飼藥物 造模手術(shù)后1月，各組大鼠均等體積灌胃飼養(yǎng)，其中空白對(duì)照組和模型組給予生理鹽水，骨靈片組根據(jù)人鼠劑量換算標(biāo)準(zhǔn)，給予

9、骨靈片以高(5.40g.kg-1.d-1)、中(2.70 g.kg-1.d-1)、低(1.35 g.kg-1.d-1)劑量灌胃，各組給藥劑量均按臨床等效劑量換算。 5．OPG、RANKL、PICP及IL-6、TNF-α、IL-4的檢測(cè)大鼠灌藥后3月，心臟采血，4℃、3000rpm/min離心10mn后血清保存于-20℃冰箱中待檢測(cè)，操作均按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。 6．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)均以SPSS13.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件包

10、處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，采用Oneway-ANOVA分析，方差齊性檢驗(yàn)，組間比較使用LSD方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理：方差不齊檢驗(yàn)，采用T<,2>方法處理。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：1、去勢(shì)后大鼠可通過上調(diào)血清中OPG的表達(dá)水平來對(duì)抗OP，但RANKL的表達(dá)也明顯上調(diào)，且上調(diào)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過OPG表達(dá)的水平，故OPG/RANKL比值仍然下降，同時(shí)機(jī)體內(nèi)骨吸收刺激因子IL-6、TNF-α表達(dá)水平上升，IL-4表達(dá)水