沉默Keap1基因?qū)腔嚓P基因和砷代謝相關指標的影響及在砷皮膚角化異常中的作用.pdf

1、目的：以慢病毒介導的Keap1基因沉默的人角質(zhì)形成細胞株HaCaT細胞為模型細胞，研究Nrf2對角化相關基因和砷代謝相關指標的影響及在砷致皮膚毒性中作用，為砷致皮膚毒性機制提供理論依據(jù)。
　　方法：1.Keap1 shRNA的構建：利用RNAi技術，以人Keap1基因為靶基因，設計Keap1基因特異性的小干擾RNA，構建其shRNA，重組慢病毒表達載體，并進行測序鑒定。2.慢病毒包裝：用重組成功的表達載體轉染包裝細胞293T，收集

2、、濃縮病毒上清液、測定其滴度；3.Keap1沉默Hacat細胞模型的構建，構建好的三種慢病毒分別感染HaCaT細胞（MOI=5）,感染48小時后，用1ug/ml的嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細胞株。4.穩(wěn)定細胞株的鑒定：篩選出穩(wěn)定的細胞株，用實時熒光定量(Real-Time Quantitative PCR)檢測干擾效率。5.細胞培養(yǎng)與染毒：模型細胞與正常細胞按細胞常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)。6.MTT法檢測細胞生長狀況，確定染毒濃度，染毒濃度別為LC50的

3、1/100、1/50、1/10。7.流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況：參照相關試劑盒說明書。8.實時熒光定量PCR檢測細胞中Nrf2、K1、K10、INV、LOR、NF-кB、N6AMT1 mRNA的表達水平。9.ELISA法檢測細胞中COX-2、N6AMT1、SAM、HCY的蛋白表達水平。
　　結果：1.慢病毒干擾載體構建測序結果顯示重組載體構建成功。2.慢病毒滴度測試結果：依據(jù)滴度（TU/ml）=細胞數(shù)×百分比×MOI(1)×病毒

4、稀釋倍數(shù)×10^3選取最佳滴度的病毒。3.選取Keap1 shRNA1 Hacat細胞，其基因的沉默效率為71％。4.混合砷液染毒2.90μmol/L、5.80μmol/L、29.00μmol/L，分別為低、中、高劑量組，陰性對照組和空白對照組染毒濃度為0μmol/L。5.細胞增殖：2.90μmol/L混合砷液染毒細胞，細胞明顯增殖；5.80μmol/L混合砷液染毒細胞72h開始出現(xiàn)明顯抑制；29.00μmol/L混合砷液染毒細胞48h

5、開始明顯抑制細胞增殖。空白對照細胞增值率略低于0μmol/L染毒組。6.細胞凋亡：2.90μmol/L染毒時，各時間段細胞凋亡率均低于正常對照組，提示2.90μmol/L混合砷液染毒細胞，在促進細胞增殖同時，誘導細胞凋亡率降低；5.80μmol/L、29.00μmol/L染毒組隨著染毒劑量的增加，細胞凋亡率也逐漸增加。7.2.90μmol/L、5.80μmol/L混合砷染毒Keap1沉默細胞8h、24h后能促進Nrf2、K1、K10、I

6、NV、N6AMT1、NF-κB mRNA的表達上調(diào)；29.00μmol/L的混合砷染毒72h可使Keap1沉默細胞中Nrf2、K1、K10、INV、N6AMT1、NF-κB mRNA表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。8.2.90μmol/L、5.80μmol/L混合砷染毒Keap1沉默細胞能促進N6AMT1、COX-2、SAM、HCY蛋白的表達；29.00μmol/L混合砷染毒Keap1沉默細胞 N6AMT1、SAM、HCY蛋

7、白的表達量下降差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；29.00μmol/L COX-2蛋白的表達量仍遠于對照組且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結論：1.細胞增殖：2.90μmol/L混合砷液染毒細胞，細胞明顯增殖；5.80μmol/L混合砷液染毒細胞72h開始出現(xiàn)明顯抑制；29.00μmol/L混合砷液染毒細胞48h開始明顯抑制細胞增殖。空白對照細胞增值率略低于0μmol/L染毒組，提示沉默Keap1基因后Nrf2高表達有利

8、于細胞的增殖，混合砷液對細胞的增殖影響具有時間-劑量依賴性。細胞凋亡：2.90μmol/L混合砷液染毒細胞，在促進細胞增殖同時，誘導細胞凋亡率降低；5.80μmol/L、29.00μmol/L染毒組隨著染毒劑量的增加，細胞凋亡率也逐漸增加；隨著染毒時間的延長，細胞的凋亡率也上升，提示混合砷液誘導細胞凋亡具有一定的時間-劑量依賴性。2.混合砷染毒Keap1沉默HaCaT細胞，Nrf2處于高表達狀態(tài)，隨著染毒時間延長、染毒濃度增加基因有下調(diào)

9、趨勢，但明顯高于未轉染組。3.混合砷染毒能使Keap1沉默HaCaT細胞中K1、K10、INV、N6AMT1、NF-κB mRNA表達發(fā)生改變，隨著染毒時間延長、染毒濃度增加能使基因表達逐漸下調(diào)。4.Keap1沉默HaCaT細胞染毒后在8h、24h檢測到LORmRNA表達為陰性，2.90μmol/L、5.80μmol/L染毒組在72h檢測到LOR mRNA上調(diào)，29.00μmol/L組在48h、72h檢測到LOR mRNA上調(diào)。5.混合