三氧化二砷誘導APL細胞凋亡的分子機制——線粒體在凋亡中的作用及凋亡相關基因表達變化的基因芯片研究.pdf

1、急性早幼粒細胞白血病(Acute promyelocytic leukemia,APL)是血液系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，病因尚不完全清楚，主要病變?yōu)楣撬柚械脑缬琢＜毎ミM一步分化成熟的能力而停滯在早幼粒階段。三氧化二砷(Arsenic trioxide，As<,2>O<,3>)用于臨床治療APL已有許多成功的范例，并已成為臨床治療APL的有效措施。研究表明，砷劑作用的重要機制就是它能有效地誘導APL細胞凋亡。目前的研究發(fā)現(xiàn)多種細胞核基

2、因組表達基因的改變參與了As<,2>O<,3>誘導的APL細胞凋亡過程。利用基因芯片技術對As<,2>O<,3>誘導APL細胞凋亡過程中凋亡相關基因表達的報告鮮見。有資料顯示一些作用于線粒體外膜的基因表達參與了As<,2>O<,3>誘導的腫瘤細胞凋亡的調控，且線粒體在細胞凋亡過程中起著至關重要的作用。但線粒體基因組在該過程中是否表達，線粒體基因組在細胞凋亡中的作用及地位目前未見相關文獻報道。因此探討As<,2>O<,3>誘導NB4細胞凋

3、亡過程中線粒體基因組的表達對于進一步闡明As<,2>O<,3>的作用機制具有重要的意義。 本課題采用熒光顯微鏡、透射電鏡、流式細胞儀、DNA Ladder、細胞生長抑制實驗、線粒體膜電位檢測、RT-PCR等方法，研究As<,2>O<,3>對NB4細胞的誘導凋亡、生長抑制作用；設計線粒體基因組引物，在基因及蛋白質水平對線粒體基因組在該過程中的差異表達進行研究；利用基因芯片技術對1384個凋亡相關基因在As<,2>O<,3>誘導AP

4、L細胞凋亡過程中的表達進行研究，為進一步探討As<,2>O<,3>誘導APL細胞凋亡的分子機制提供有力線索，為As<,2>O<,3>在APL及惡性腫瘤中的應用提供依據(jù)。主要的研究結果如下： 1．NB4細胞經(jīng)As<,2>O<,3>誘導凋亡后呈現(xiàn)凋亡的形態(tài)學改變。熒光顯微鏡顯示NB4細胞經(jīng)As<,2>O<,3>處理48h后出現(xiàn)細胞核致密濃染、染色質固縮及片斷化斷裂，甚至呈碎片狀。透視電鏡顯示細胞核皺縮，形態(tài)不規(guī)則，染色質邊集。對照細

5、胞未見形態(tài)學改變。 2．As<,2>O<,3>對NB4細胞具有明顯的生長抑制作用。As<,2>O<,3>作用于NB4細胞后，在一定的濃度范圍內(0.5umol/L-8umol/L)，在同一時間點，隨著As<,2>O<,3>濃度的升高，其對NB4細胞的生長抑制率逐漸升高，生長抑制曲線呈“S”型改變，具有明顯的量-效效應；而同一濃度的As<,2>O<,3>，其對NB4細胞的生長抑制率隨著作用時間的延長而升高，具有明顯的時一效效應。給

6、予8umol/L As<,2>O<,3>處理NB4細胞后其生長抑制率于24h、48h、72h分別達到78.8％、91.2％和100％。 3．流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)NB4細胞經(jīng)0.5umol/L、1umol/L、2umol/L、3umol/LAs<,2>O<,3>其細胞凋亡率分別為5.02％、6.40％、28.40％、33.34％。As<,2>O<,3>濃度越高，NB4細胞凋亡率越高，二者之間具有一定的量效關系。 4．以0.

7、5umol/L、1umol/L、2umol/L、4umol/L、8umol/L As<,2>O<,3>分別處理NB4細胞48h后，流式細胞儀檢測NB4細胞線粒體膜電位分別下降12.8％、21.6％、66.9％、83.7％、83.8％。 5．RT-PCR對As<,2>O<,3>誘導NB4細胞凋亡過程中的13個線粒體基因組基因進行篩選發(fā)現(xiàn)COX2在As<,2>O<,3>誘導NB4細胞凋亡過程表達下調，其余12個基因表達無明顯改變，W

8、estern Blot分析顯示COX2在蛋白質水平表達呈降調節(jié)。 6．通過對1384個凋亡相關基因的mRNA制備的寡核苷酸芯片的研究發(fā)現(xiàn)，NB4經(jīng)2umol/LAs<,2>O<,3>誘導凋亡后有16個基因出現(xiàn)差異表達，其中MT2A、SST、NFAT5、SERPINB5等4個基因表達上調，EIF4G2、FDXR、CCT5、TFDP1、PRG1、P2RY6、MPO、ANP32A、CEPBA、HLA-B、YWHAE、TXNDC5等12

9、個基因表達下調，選取其中改變最顯著的4個基因進行RT-PCR驗證，結果與基因芯片結果一致。 結論： 1、As<,2>O<,3>在體外具有顯著的誘導急性早幼粒白血病細胞(NB4細胞)凋亡及生長抑制效應，這種效應在一定濃度范圍內呈現(xiàn)出量效及時效關系。 2、As<,2>O<,3>誘導NB4細胞的凋亡作用與線粒體的膜電位下降密切相關，隨著細胞凋亡率的提高，線粒體膜電位呈現(xiàn)下降趨勢。 3、線粒體相關基因COX2的表

10、達變化可能參與了As<,2>O<,3>誘導的NB4細胞凋亡過程。 4、在As<,2>O<,3>誘導的NB4細胞凋亡過程中，MT2A、SST、NFAT5、SERPINB5等4個基因表達的升調節(jié)及EIF4G2、FDXR、CCT5、TFDP1、PRG1、P2RY6、MPO、ANP32A、CEPBA、HLA B、YWHAE、TXNDC5等12個基因表達的降調節(jié)可能參與了這一過程，上述基因表達的變化與As<,2>O<,3>誘導的NB4細胞