三氧化二砷誘導(dǎo)血小板凋亡及其相關(guān)機(jī)制探討.pdf

1、目的:
　　探討臨床使用濃度的三氧化二砷(Arsenic trioxide,ATO)是否會(huì)誘導(dǎo)血小板凋亡,并研究ATO誘導(dǎo)血小板凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。
　　方法:
　　收集健康志愿者新鮮靜脈全血,分離得到洗滌血小板及富含血小板血漿(Platelet rich plasma,PRP)。洗滌血小板(3×108/ml)與不同濃度ATO或者陰性對(duì)照二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)于37℃孵育5小時(shí),使

2、用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板線粒體跨膜電位(Mitochondrial inner transmembrane potential,ΔΨm)變化、磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)外翻、血小板活化指標(biāo)P-選擇素(P-Selectin)及血小板激活復(fù)合物(Patelet activated complex-1,PAC-1)的結(jié)合率。使用Western blot檢測(cè)ATO與正常人洗滌血小板孵育后血小板促凋亡蛋白Bax,抗凋

3、亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL的表達(dá)和caspase-3的活化情況。為了探明c-Jun氨基末端激酶(c-jun NH2-terminal kinase,JNK)蛋白家族在ATO誘導(dǎo)的血小板凋亡過(guò)程中的作用,我們使用JNK蛋白特異性抑制劑雙香豆素抑制JNK蛋白活性,之后使用流式檢測(cè)ATO誘導(dǎo)的血小板ΔΨm的變化。同時(shí)我們研究了ATO對(duì)不同致聚劑誘導(dǎo)血小板聚集功能的影響,探討ATO對(duì)血小板功能有無(wú)損傷,將PRP與ATO(2μM)或者陰性對(duì)照

4、(DMSO)于37℃孵育1小時(shí),洗滌血小板與ATO(16μM)或陰性對(duì)照(DMSO)于37℃孵育2小時(shí)后,PRP中加入膠原(Collagen,5μg/mL)或者二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate,ADP,10μmol/L),洗滌血小板中加入凝血酶(Thrombin,0.5U/mL),1000rpm剪切力的情況下,使用血小板聚集儀檢測(cè)血小板聚集程度。ATO治療相關(guān)血小板減少已經(jīng)在臨床中被大量報(bào)道,為了探明ATO是否會(huì)引

5、起循環(huán)血小板計(jì)數(shù)減少,我們通過(guò)連續(xù)注射臨床使用濃度的ATO至實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi),之后使用Sysmex KX-21N血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定小鼠血小板計(jì)數(shù),研究ATO對(duì)C57小鼠外周血血小板數(shù)量有無(wú)影響。
　　結(jié)果:
　　1.ATO誘導(dǎo)血小板凋亡
　　體外研究結(jié)果顯示,與正常陰性對(duì)照相比,ATO劑量依賴(lài)性誘導(dǎo)血小板ΔΨm去極化以及PS外翻,Western blot檢測(cè)ATO與正常人洗滌血小板孵育后,血小板抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-

6、XL下調(diào),促凋亡蛋白Bax增強(qiáng)表達(dá),ATO劑量依賴(lài)性誘導(dǎo)血小板caspase-3活化裂解,且ATO劑量依賴(lài)性引起JNK活化,使用JNK特異性抑制劑雙香豆素可以抑制ATO誘導(dǎo)的血小板ΔΨm去極化,然而雙香豆素并不能完全抑制這一過(guò)程,提示可能有其它信號(hào)途徑參與這一過(guò)程。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ATO通過(guò)caspase依賴(lài)的線粒體途徑誘導(dǎo)血小板凋亡。
　　2.ATO損傷血小板聚集功能
　　既往研究表明,ATO抑制花生四烯酸、腎上腺素、凝

7、血酶以及U46619誘導(dǎo)的血小板聚集,然而對(duì)于膠原誘導(dǎo)的血小板聚集存在不同的觀點(diǎn)。我們通過(guò)研究表明,ATO抑制膠原、ADP以及凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集,提示ATO損傷血小板的聚集功能。
　　3.小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　大量研究表明,ATO治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acute promyelocytic leukemia,APL)或者其他惡性腫瘤過(guò)程中常伴隨血小板減少。然而,相關(guān)機(jī)制仍不清楚。我們上述研究已經(jīng)表明,ATO在體外能夠誘導(dǎo)

8、血小板凋亡,為了進(jìn)一步探明ATO是否對(duì)循環(huán)血小板計(jì)數(shù)產(chǎn)生影響,臨床治療相關(guān)劑量的ATO或0.9％生理鹽水(Normal saline,NS)對(duì)照通過(guò)腹腔注射C57小鼠,連續(xù)5天,之后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定外周血血小板計(jì)數(shù)變化。實(shí)驗(yàn)表明,通過(guò)連續(xù)腹腔注射臨床使用濃度的ATO使小鼠外周血血小板計(jì)數(shù)發(fā)生減少。
　　結(jié)論:
　　綜上所述,ATO通過(guò)caspase依賴(lài)的線粒體途徑誘導(dǎo)血小板凋亡,JNK蛋白家族在其中發(fā)揮重要作用,ATO不