阿司匹林增強肝素鈉相關的ADP誘導的血小板聚集及其可能機制.pdf

1、目的:研究在體及離體情況下肝素鈉(UFH)對血小板聚集的影響,探討阿司匹林對UFH相關ADP誘導的血小板聚集可能的增強作用并初步探討其機制。
　　 方法:純種新西蘭家兔16只,靜脈注射肝素鈉200IU/kg前(0min)及注射后20min采血,檢測并比較全血二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)、誘導的血小板聚集。后隨機分為兩組:阿司匹林組和氯吡咯雷組。阿司匹林組首先給予阿司匹林(巴米爾12mg/Kg.d)灌胃,連用7天(第1

2、～7天);而后加用氯吡格雷(4mg/Kg.d)雙藥聯(lián)合灌胃7天(第8～14天),分別于第7天和第14天靜脈注射肝素鈉200IU/kg,注射前(0min)及注射后20min采血,檢測并比較全血ADP、AA誘導的血小板聚集。氯吡格雷組首先予以氯吡格雷(4mg/Kg.d)灌胃,連用7天(第1～7天);而后加用阿司匹林(巴米爾12mg/Kg.d)雙藥聯(lián)合灌胃7天(第8～14天),分別在第7天和第14天靜脈注射肝素鈉(用量同前),注射前(0min

3、)及注射后20min采血,檢測并比較全血ADP、AA誘導的血小板聚集。
　　 純種新西蘭家兔12只,靜脈注射達肝素鈉200IU/kg前(0min)及注射后20min采血,檢測并比較全血ADP、AA誘導的血小板聚集。后隨機分為阿司匹林組和氯吡咯雷組兩組。阿司匹林組首先給予阿司匹林(巴米爾1.2mg/Kg.d)灌胃,連用7天(第1～7天);而后加用氯吡格雷(4mg/Kg.d)雙藥聯(lián)合灌胃7天(第8～14天)。分別于第7天和第14天靜

4、脈注射達肝素鈉200IU/kg,注射前(0min)及注射后20min采血,檢測并比較全血血小板聚集。氯吡格雷組首先予以氯吡格雷(4mg/Kg.d)灌胃,連用7天(第1～7天);而后加用阿司匹林(巴米爾12mg/Kg.d)雙藥聯(lián)合灌胃7天(第8～14天)。分別在第7天和第14天靜脈注射達肝素鈉(用量同前),注射前(0min)及注射后20min采血,檢測并比較全血ADP、AA誘導的血小板聚集。
　　 在前期動物實驗的基礎上,分析比較

5、了不同濃度的肝素鈉對人體外血小板聚集作用。取新鮮機采健康成人血小板懸液24人份,每份5毫升,每份標本平均分為五組,每組1毫升,分別加入終濃度為1IU/mL～4IU/mL的肝素鈉及空白對照管(血小板原液)共同置于恒溫水浴槽,37℃恒溫孵育10分鐘分別檢測ADP(終濃度為10umol/L)誘導的血小板聚集。新鮮機采健康成人血小板懸液36人份,每份5毫升,分組及藥物干預同上,37℃恒溫孵育20分鐘分別檢測ADP(終濃度同前)誘導的血小板聚集。

6、
　　 基于前面的實驗研究,我們進一步探討了肝素鈉增強ADP誘導的血小板聚集機制,同時應用阿司匹林與人血小板體外共孵育,進一步探討阿司匹林對于人肝素鈉相關ADP誘導的血小板聚集的可能的增強作用及其可能的機制。
　　 取新鮮機采人血小板懸液56人份,每份5毫升,每份標本平均分為五組:①血小板原液預孵育5分鐘后加入肝素4IU/mL;②阿司匹林(終濃度為100umol/L)37℃預孵育5分鐘后加入肝素41IU/mL;③阿司匹林

7、和A2P5P(終濃度為300umol/L)37℃預孵育5分鐘后加入肝素4IU/mL;④A2P5P(終濃度同前)37℃預孵育5分鐘后加入肝素4IU/mL;⑤生理鹽水等量預孵育5分鐘,37℃恒溫孵育10分鐘及20分鐘,分別檢測各組ADP誘導的血小板聚集。
　　 VASP是血小板內蛋白,其磷酸化依賴于P2Y12受體的活性。應用流式細胞術方法可定量檢測VASP磷酸化(VASP-P)水平并計算血小板反應指數(shù)(platelet reacti

8、vity index,PRI)?；谇懊鎸嶒炈幬锓跤?0分鐘作用最強,故在此試驗中,選取20分鐘作為孵育時間。健康人人機采血小板懸液40人份,每份4毫升,每人份血小板平均分為四組,每組1毫升,分別給予:①血小板原液37℃恒溫孵育5分鐘再加入肝素鈉(終濃度為4IU/mL)37℃恒溫孵育20分鐘②首先加入ASA(終濃度為100umol/L)37℃恒溫孵育5分鐘,再加入肝素鈉(濃度同前)恒溫孵育20分鐘;③首先加入A2P5P(終濃度為300u

9、mol/L)和ASA(濃度同前)37℃恒溫孵育5分鐘,再加入肝素鈉(濃度同前)恒溫孵育20分鐘;④加入生理鹽水等量37℃恒溫孵育25分鐘。預處理后的血小板分別檢測VASP磷酸化水平。根據(jù)靜息態(tài)(+PGE1)和激活態(tài)(PGE1+ADP)時矯正的平均熒光強度(cMFI)計算血小板反應性指數(shù)(PRI)。
　　 PRI=[(MFIPGE1-MFIPGE1+ADP)/MFIPEG1]×100
　　 另外,我們在透射電鏡下觀察了人血

10、小板在不同濃度肝素鈉刺激下以及在阿司匹林和肝素鈉共同作用下對血小板超微結構變化,以求從多個角度觀察肝素鈉或阿司匹林和肝素鈉對血小板的激活現(xiàn)象。因為在前面實驗中可見肝素鈉與血小板共孵育20分鐘時血小板活化現(xiàn)象最明顯,所以在這組研究中我們取藥物孵育20分鐘作為觀察時間點。
　　 人新鮮機采血小板懸液6份,每份7ml,每份平均分成七組,分別給予:①～④血小板原液37℃預孵育5分鐘,然后分別加肝素鈉1IU/mL-4IU/mL;⑤ASA(

11、終濃度同前)37℃預孵育5分鐘后加肝素鈉4IU/L;⑥ASA(終濃度同前)和A2P5P(終濃度同前)37℃預孵育5分鐘后肝素鈉4IU/mL;共同置于37℃水浴箱孵育20分鐘⑦血小板原液(空白對照組)37℃水浴箱孵育25分鐘。后各管加入等量0.3％戊二醛固定液,混勻,室溫下固定10min,2000 r·min-1離心8 min,棄上清液,再加入4％戊二醛固定液室溫固定30min。輕輕撥出試管內表面的黃膜,0.1 mol/L,磷酸緩沖液洗3

12、次,將黃膜修成1.5x2mm小塊,再放入3％的緩沖戊二醛液內4℃下固定3h。1％鋨酸后固定2h。乙醇系列脫水,丙酮置換,環(huán)氧樹脂Epon812包埋,超薄切片,醋酸鈾及硝酸鉛雙重染色,觀察細胞超微結構并拍照。
　　 血小板聚集的測定應用阻抗法,每次檢測記錄血小板最大聚集Ω值及5分鐘時血小板殘余聚集Ω值;同一份標本上機檢測兩次,記錄兩次檢測結果平均值;血小板采集到檢測最長時間為2小時。
　　 結論:肝素鈉增強ADP誘導的血小