薤白皂苷抑制ADP誘導大鼠血小板活化及聚集的蛋白質組學研究.pdf

1、【目的】
　　1.設立冠心病患者組并以健康志愿者為對照，運用蛋白質組學技術分離和鑒定相關差異蛋白，初步闡明差異蛋白在冠心病中的作用。
　　2.分別測定不同劑量薤白皂苷化合物對ADP誘導活化的大鼠血小板膜糖蛋白CD62P表達率及血小板聚集率的影響，探討薤白皂苷化合物對血小板活化和聚集過程的影響。
　　3.應用蛋白質組學技術鑒定出最優(yōu)劑量薤白皂苷化合物作用下的大鼠血小板差異蛋白，探究差異蛋白在血小板活化及聚集中的作用。

2、r>　　【研究方法】
　　1.為探討冠心病患者血小板蛋白質組學改變，本研究納入冠心病患者組以及健康志愿者人組作為實驗對象，靜脈抽取10ml空腹全血，采用差速離心的方法制備血小板，將血小板溶于Lysis buffer中，并通過丙酮沉淀的方法提取蛋白，用基質輔助激光解析/電離-飛行時間質譜技術（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectro

3、metry，MALDI-TOF-TOF）進行鑒定，并查詢差異蛋白作用。分析其對冠心病發(fā)展的影響。
　　2.為了驗證薤白皂苷作用后血小板活化功能的改變，研究選擇雄性SD大鼠為實驗對象。用生理鹽水（2mL/d）、阿司匹林（30mg/kg/d）、不同濃度（168mg/kg、337mg/kg、674mg/kg）的薤白皂苷化合物灌胃大鼠7天后，制備大鼠血小板懸液，加入終濃度20μM ADP激活10min。檢測大鼠血小板膜糖蛋白CD62P表達

4、率，探討不同劑量薤白皂苷化合物作用血小板后的活化功能改變。
　　3.為了驗證薤白皂苷作用后血小板聚集功能的改變，研究選擇雄性SD大鼠為實驗對象。用生理鹽水（2mL/d）、阿司匹林（30mg/kg/d）、不同濃度（168mg/kg、337mg/kg、674mg/kg）的薤白皂苷化合物灌胃大鼠7天后，制備大鼠血小板懸液，加入終濃度20μM ADP激活10min。檢測大鼠血小板聚集率，探討不同劑量薤白皂苷化合物作用血小板后的聚集功能改變

5、。
　　4.為了鑒定最優(yōu)劑量薤白皂苷化合物作用下的大鼠血小板差異蛋白，探討薤白皂苷對ADP誘導大鼠血小板的蛋白質組影響。研究選擇雄性SD大鼠為實驗對象，實驗分為2個處理組：2mL/d生理鹽水對照組、最優(yōu)劑量薤白皂苷組（經檢測為抑制血小板活化和聚集的最優(yōu)劑量）。用上述劑量灌胃大鼠7天后制備血小板懸液，加入終濃度20uM ADP激活10min。提取血小板蛋白質采用蛋白質組學技術分離及鑒定，并探究差異蛋白在血小板活化和聚集環(huán)節(jié)所起作用。

6、
　　【結果】
　　1.通過雙向電泳分別獲得2張冠心病患者凝膠和健康志愿者凝膠，分析出17個差異蛋白。質譜鑒定并搜索數據庫后發(fā)現(xiàn)，與健康志愿組相比，冠心病組有7個蛋白表達出現(xiàn)差異：Plastin-2、Coronin-1A、Clusterin、Annexin A1、Chloride intracellular channel protein1、Peroxiredoxin-6、Peroxiredoxin-2。
　　2.流式

7、細胞術結果顯示，與對照組相比，不同濃度（168mg/kg、337mg/kg、674mg/kg）的薤白皂苷均能一定程度上降低CD62P表達率，且呈一定的濃度依賴性，且薤白高劑量組抑制作用最為顯著。
　　3.血小板聚集率結果顯示，不同濃度（168mg/kg、337mg/kg、674mg/kg）的薤白皂苷與對照組相比，均能一定程度上抑制血小板的聚合作用，且亦呈一定的濃度依賴性。根據血小板抑制率公式計算阿司匹林組、薤白低劑量組、薤白中劑量

8、組、薤白高劑量組對ADP誘導的大鼠血小板聚集的抑制率依次為19.08％、14.46%、22.06%、33.85%。薤白高劑量組作用更為突出。
　　4.薤白皂苷高劑量處理組和對照組血小板總蛋白分別獲得3張凝膠圖譜，質譜并搜索數據庫后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，薤白高劑量處理組有7個蛋白點表達改變：Calreticulin、Actin、LIM and SH3 domain protein1、RCG55135、Protein phosphata

9、se1、Suppressor of IKBKE1、Ribulose-5-phosphate-3-epimerase。
　　【結論】
　　1.血小板蛋白質Plastin-2、Peroxiredoxin-2、Peroxiredoxin-6、Annexin A1、Chloride intracellular channel protein1、Clusterin、Coronin-1A是冠心病患者與健康人差異表達蛋白。
　　2.