丁苯酞抗血小板聚集作用及其機(jī)制和NOD2在血小板中表達(dá)及功能的研究.pdf

1、目的
　　血管損傷時(shí)血小板活化參與損傷修復(fù)反應(yīng)，對于生理止血過程十分重要。病理性條件下如動脈粥樣板塊自發(fā)性破裂或斑塊侵蝕等，循環(huán)血液中的血小板異?；罨纬蓜用}血栓將導(dǎo)致血管狹窄或閉塞，致使機(jī)體組織局部缺血或供血中斷。這些是冠心病、急性冠脈綜合征、缺血性腦卒中等當(dāng)今威脅我國人民及許多發(fā)達(dá)國家人民健康的首要疾病的病理基礎(chǔ)。隨著對血小板功能研究的不斷深入，研究表明抑制血小板活化的抗血小板藥對冠心病、中風(fēng)的預(yù)防、治療效果肯定。
　　

2、丁苯酞(3-n-butylphthalide，NBP)是從芹菜籽中提取出來的特定成份并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾而得到的新型化合物。2002年，丁苯酞（商品名為恩必普）獲得中國SFDA批準(zhǔn)，成為我國腦血管領(lǐng)域第一個(gè)擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的一類新藥。臨床試驗(yàn)證實(shí)，口服制劑及針劑丁苯酞具有很強(qiáng)的抗腦缺血作用，對急性缺血性腦卒中的治療有滿意的療效，同時(shí)副作用較小。2010年，丁苯酞軟膠囊被編入我國《國家處方集》腦血管病指導(dǎo)用藥，臨床用于治療輕、中度急性缺血性腦卒

3、中的各個(gè)病理過程。
　　以往的研究，使用體外、半體外比濁法證實(shí)丁苯酞對膠原、ADP、花生四烯酸誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集有明顯抑制作用;對大鼠灌胃給予丁苯酞后，觀察到左旋體和消旋體丁苯酞可劑量依賴性地抑制大鼠血栓形成，并能使剪鼠尾后的出血時(shí)間延長2.1倍。然而，丁苯酞抗血栓、抗血小板作用的具體機(jī)制仍不明確。本研究對丁苯酞（消旋體及左旋體）體外抗人血小板聚集活性及其抗血小板的作用靶點(diǎn)進(jìn)行了研究，從而對臨床應(yīng)用該藥物給出一定的參考價(jià)值。

4、r>　　方法
　　實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們當(dāng)場采集健康志愿獻(xiàn)血者的肘靜脈全血。使用FITC-PAC-1標(biāo)記血小板活化糖蛋白GPⅡb/Ⅲa，通過全血法流式細(xì)胞儀檢測丁苯酞對人血小板活化的作用;我們制備了未經(jīng)阿斯匹林處理和經(jīng)阿司匹林處理人的洗滌系血小板，用丁苯酞（消旋體及左旋體）處理血小板后，加入血小板激動劑ADP、凝血酶、膠原、U46619、花生四烯酸誘導(dǎo)血小板聚集，觀察并記錄其抗血小板聚集活性及對血小板ATP釋放的影響;對其作用機(jī)制進(jìn)行探討時(shí)

5、，我們使用柱層析法，加入[3H]腺嘌呤標(biāo)記，檢測丁苯酞對forsklin升高的ADP誘導(dǎo)的血小板內(nèi)cAMP水平的影響;通過使用高效液相法檢測酶反應(yīng)體系中剩余底物的含量，進(jìn)而反映丁苯酞對血小板提取的磷酸二酯酶(PDEs)活性的作用;此外，我們使用ELISA試劑盒，檢測丁苯酞對ADP、凝血酶、膠原誘導(dǎo)的血小板內(nèi)血栓烷A2生成的作用;最后，我們使用Fluo-3負(fù)載血小板，檢測丁苯酞對ADP誘導(dǎo)的血小板內(nèi)游Ca2+水平的影響。
　　結(jié)果<

6、br>　　根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在全血條件下，丁苯酞（消旋體及左旋體）300μM可顯著抑制由ADP10μM誘導(dǎo)的血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa的活化;在10-300μM范圍中，丁苯酞（消旋體及左旋體）可顯著濃度依賴性地抑制由ADP10μM、凝血酶0.05 U/mL、膠原1μg/mL、U466191μM、花生四烯酸0.5 mM誘導(dǎo)的人洗滌血小板聚集和ATP釋放;同時(shí)，我們觀察到丁苯酞對ADP、凝血酶誘導(dǎo)的聚集的抑制作用，在未經(jīng)阿司匹林處理?xiàng)l件下

7、強(qiáng)于經(jīng)阿司匹林處理?xiàng)l件，而丁苯酞對U46619誘導(dǎo)的聚集的抑制作用在經(jīng)阿司匹林處理后反而相對更強(qiáng)，提示其抗血小板作用可能與抑制TXA2的生成有關(guān);丁苯酞（消旋體及左旋體）300μM在從人血小板提取的磷酸二酯酶反應(yīng)體系中，可顯著增高酶底物cAMP的剩余含量，證明丁苯酞有抑制磷酸二酯酶的作用;此外，丁苯酞（消旋體及左旋體）300μM對ADP10μM誘導(dǎo)的血小板內(nèi)cAMP降低的抑制作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示其作用靶點(diǎn)非P2Y12-Gi信號通路;最

8、后，在10-300μM的濃度范圍內(nèi)，丁苯酞濃度依賴性地顯著抑制ADP、凝血酶和膠原誘導(dǎo)的TXA2生成;丁苯酞（消旋體及左旋體）100μM能夠明顯降低由ADP10μM誘導(dǎo)的血小板內(nèi)Ca2+升高。
　　結(jié)論
　　1.丁苯酞（消旋體及左旋體）在體外對多種激動劑誘導(dǎo)的血小板激活具有較強(qiáng)的抑制作用。
　　2.丁苯酞（消旋體及左旋體）抗血小板作用的機(jī)制主要為抑制TXA2的生成和抑制磷酸二酯酶。
　　第二部分NOD2在血小板中

9、的表達(dá)與功能的研究
　　血小板是從骨髓來源巨核細(xì)胞上脫落下來的無核“細(xì)胞碎片”，流動于機(jī)體血液循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)。血小板的主要功能是參與凝血和止血，限制血管損傷處進(jìn)一步出血。然而，血小板的異常激活將會導(dǎo)致急性冠脈綜合征、缺血性腦中風(fēng)等嚴(yán)重動脈血栓性疾病。此外，血小板與動脈粥樣硬化、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移等病理過程有關(guān)聯(lián)?；罨难“迥軌虮磉_(dá)分泌炎性因子如P-選擇素及CD40L等。許多在白細(xì)胞表達(dá)的信號分子在血小板中也有表達(dá)。NOD作為白細(xì)胞表達(dá)的

10、模式識別受體，在宿主抗侵入細(xì)菌的天然免疫(innate immunity)中具有重要作用。NOD主要有NOD1和NOD2。越來越多的證據(jù)表明，NOD2基因突變與炎癥性腸疾病Blau綜合征的發(fā)病有密切關(guān)聯(lián)，也與克隆氏病的易感性增加相關(guān)。目前已知NOD2主要在單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)，但NOD2是否在血小板中表達(dá)，以及是否在血小板有功能均未見報(bào)道。
　　我們首次發(fā)現(xiàn)血小板NOD2表達(dá)而且有功能。我們分別在mRNA水平及蛋白水平發(fā)現(xiàn)人及小鼠血小

11、板表達(dá)高水平的NOD2，并發(fā)現(xiàn)野生型小鼠腹腔注射NOD2受體激動劑MDP，能夠增強(qiáng)血小板激動劑ADP、thrombin、collagen誘導(dǎo)的小鼠血小板聚集及ATP釋放，而NOD2受體敲除小鼠腹腔注射NOD2的激動劑MDP，不能增強(qiáng)激動劑ADP、thrombin、collagen誘導(dǎo)的血小板聚集及ATP釋放。接著，我們檢測了腹腔注射MDP對野性型及NOD2受體敲除小鼠血小板凝塊收縮和血小板鋪展的影響。結(jié)果顯示，MDP能夠顯著加快野生型小

12、鼠血小板凝塊收縮速度，但是對血小板鋪展沒有明顯作用;NOD2受體敲除小鼠MDP組與NS組血小板凝塊收縮速度均相對減慢，兩組間無明顯差異;NOD2受體敲除小鼠MDP組與NS組血小板鋪展亦無明顯差異，并與野生型小鼠的血小板鋪展面積相似。最后，我們還應(yīng)用電鏡分析血小板的形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)給予MDP刺激后野生型小鼠血小板明顯具有活化趨勢，而對NOD2受體敲除小鼠血小板的結(jié)構(gòu)沒有明顯的影響。我們的結(jié)論是血小板表達(dá)NOD2，NOD2激活促進(jìn)血小板活化。