2-(α-羥基戊基)笨甲酸鉀鹽抗血小板聚集的機(jī)制及靶點(diǎn)研究.pdf

1、血栓栓塞性疾病為臨床常見病，嚴(yán)重危害著人類的生命和健康。其病因及發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，迄今尚未完全闡明，目前認(rèn)為血小板功能異常和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是血栓形成的重要因素。血栓形成是心腦缺血性疾病的主要致病因素之一。研究表明，腦缺血時(shí)，血小板功能異?？哼M(jìn)，血液處于高凝狀態(tài)，這是造成繼發(fā)性腦損傷的重要原因之一?？梢?，抗血小板聚集藥物的開發(fā)與應(yīng)用是治療腦血管疾病的有效手段，尋找有效的抗血栓藥物具有重要的臨床意義。
　　 2-（α-羥基戊基）苯

2、甲酸鉀鹽（dl-PHPB）是中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所自行設(shè)計(jì)合成的全新化合物，并已被國家食品藥品監(jiān)督局批準(zhǔn)作為抗缺血性腦卒中新藥進(jìn)行臨床研究。我室前期研究結(jié)果表明，dl-PHPB能夠顯著縮小大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷(MCAO)后的腦梗死面積，改善神經(jīng)功能缺失癥狀，減輕腦水腫體積，增加局部腦血流量，抑制大鼠血小板聚集和血栓的形成。但對(duì)其抗血小板聚集、抑制血栓形成的作用機(jī)制沒有深入研究。本研究主要從血小板活化、聚集、凝血系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)以及血管內(nèi)皮

3、細(xì)胞保護(hù)等幾方面觀察dl-PHPB的作用，并研究其機(jī)制，以期尋找其作用靶點(diǎn)。同時(shí)與其它的活血化淤中藥，如葛根素和丹酚酸B相比較，為進(jìn)一步闡明中藥抗血小板聚集的機(jī)制，開發(fā)更有效的抗血小板中藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 血小板功能活化亢進(jìn)是血栓形成的重要因素，我們首先研究了dl-PHPB對(duì)血小板功能的影響。血小板聚集活性的檢測(cè)一直是血小板體外功能評(píng)價(jià)的金標(biāo)準(zhǔn)，本次研究采用體內(nèi)給藥，體外檢測(cè)的方法，觀察了dl-PHPB對(duì)血小板聚集功能

4、的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，dl-PHPB可劑量依賴性地抑制AA、COL、ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，且對(duì)ADP引起的血小板聚集的抑制作用最強(qiáng)。在本研究中我們以ADP為誘導(dǎo)劑，探討了dl-PHPB對(duì)血小板聚集的信號(hào)通路的影響及可能的作用靶點(diǎn)。
　　 ADP與血小板膜上的G蛋白受體結(jié)合，目前已知ADP受體主要有P2Y1和P2Y12兩種受體亞型。P2Y1偶聯(lián)Gq蛋白，激活PLCβ，水解PIP2產(chǎn)生IP3和DAG，引起鈣離子釋放，增加胞漿[Ca2+

5、]i;P2Y12偶聯(lián)Gi蛋白，抑制腺苷酸環(huán)化酶，降低cAMP，最終引起血小板聚集。本研究結(jié)果顯示，無論細(xì)胞外液是否存在Ca2+，dl-PHPB均能明顯降低ADP誘導(dǎo)的血小板胞漿游離鈣含量，而且對(duì)內(nèi)鈣釋放的抑制作用強(qiáng)于抑制外鈣內(nèi)流。同時(shí)dl-PHPB增加磷酸化PLCβ(ser1105)的蛋白表達(dá)，不影響PLC總蛋白的表達(dá)。PLC激動(dòng)劑部分逆轉(zhuǎn)dl-PHPB的抗血小板聚集作用。dl-PHPB明顯抑制ADP引起的血小板IP1含量增加，對(duì)PLC

6、激動(dòng)劑引起的IP1增加無明顯影響。以上結(jié)果表明，P2Y1受體參與了dl-PHPB的抗血小板聚集作用。PGE1可使血小板中cAMP含量迅速增加，ADP與P2Y12受體結(jié)合，降低cAMP含量，拮抗PGE1的作用?？寡“逅庎缏绕ザㄞ卓笰DP與P2Y12受體的結(jié)合，增加cAMP含量。研究結(jié)果顯示dl-PHPB并不影響cAMP的含量，與噻氯匹定的作用不同。同時(shí)dl-PHPB對(duì)PI3K、Akt及磷酸化Akt的蛋白表達(dá)無明顯影響，提示dl-PHPB

7、并不通過P2Y12受體信號(hào)通路發(fā)揮作用。
　　 凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)、PGI2和TXA2的動(dòng)態(tài)平衡，同樣影響血小板的聚集功能。本研究檢測(cè)了靜脈給予dl-PHPB對(duì)大鼠凝血系統(tǒng)功能、纖溶系統(tǒng)活性以及PGI2和TXA2含量的影響。結(jié)果顯示dl-PHPB增加大鼠血漿6-keto-PGF1α含量，減少PAI-1含量，對(duì)凝血時(shí)間、血漿中t-PA和TXB2的含量無影響。另外，我們也觀察了dl-PHPB對(duì)血小板活化功能的影響，結(jié)果顯示dl-PH

8、PB顯著降低血小板表面CD62P的表達(dá)，抑制了血小板活化。
　　 血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的完整性對(duì)于維持血液的正常流動(dòng)和抗血栓功能的發(fā)揮起著非常重要的作用。本研究以離體培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察了dl-PHPB對(duì)脂多糖(LPS)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，同時(shí)檢測(cè)了各組中黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)。結(jié)果顯示，不同濃度的LPS作用24h后，HUVEC存活率明顯下降，黏附分子ICAM-1和VCAM-

9、1的釋放量明顯增加。dl-PHPB提高了LPS損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的存活率，抑制ICAM-1的釋放，對(duì)VCAM-1含量無明顯影響。
　　 以上研究結(jié)果提示，dl-PHPB明顯抑制血小板聚集、增強(qiáng)纖溶系統(tǒng)活性，抑制血小板活化，升高PGI2/TXA2比值，保護(hù)損傷內(nèi)皮細(xì)胞，抑制細(xì)胞間黏附分子ICAM-1的釋放，對(duì)凝血系統(tǒng)活性沒有影響。dl-PHPB通過拮抗P2Y1受體，抑制PLC活性，降低血小板胞漿游離鈣濃度，抑制血小板活化，從而抑制了A

10、DP誘導(dǎo)的血小板聚集。與臨床使用的抗血小板藥物噻氯匹定的作用靶點(diǎn)并不相同。
　　 傳統(tǒng)的活血化瘀中藥有很多具有抗血小板作用，但對(duì)其研究多集中于一些表面現(xiàn)象的研究階段，缺乏對(duì)抗血小板作用機(jī)制的深入研究。葛根素和丹酚酸B是兩個(gè)傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，具有明顯的抗血小板聚集，抑制血栓形成的作用，廣泛用于缺血性心腦血管疾病。本研究也觀察了葛根素和丹酚酸B對(duì)多種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制作用，并對(duì)其抗ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的機(jī)制與dl-PH

11、PB進(jìn)行比較，旨在尋找其作用靶點(diǎn)的異同，為祖國中藥的進(jìn)一步開發(fā)和深入研究提供依據(jù)。
　　 本研究結(jié)果顯示，葛根素和丹酚酸B均明顯抑制ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集。其中葛根素抑制ADP引起的IP1蓄積，但對(duì)PLC激動(dòng)劑引起的IP1蓄積沒有作用，這一結(jié)果提示，P2Y1受體-PLC信號(hào)通路參與了葛根素的抗血小板聚集作用，與dl-PHPB作用靶點(diǎn)相似；丹酚酸B對(duì)ADP和PLC激動(dòng)劑引起的IP1蓄積均無明顯抑制作用，提示丹酚酸B抗血小板聚集