雙靶點抗血小板新藥BF0801的作用及其機制和P2Y12受體對血小板凋亡的影響研究.pdf

1、第一部分雙靶點抗血小板藥物BF0801的作用及其機制研究
　　 中風(fēng)、冠心病為威脅我國和發(fā)達國家人民健康的首位殺手，其病理基礎(chǔ)為血小板的異常激活，抗血小板藥(抗血栓藥)預(yù)防、治療效果可靠。臨床使用的抗血小板藥有：(1)環(huán)氧化酶抑制劑阿司匹林(aspirin)；(2)噻吩吡啶類P2Y12受體拮抗劑氯吡格雷(clopidogrel)、普拉格雷；(3)纖維蛋白原受體拮抗劑(fibrinogenreceptor antagonists)

2、；(4)磷酸二酯酶抑制劑西洛他唑(ciloastazol)?，F(xiàn)有抗血小板藥的臨床療效和安全性尚不夠滿意，如阿司匹林、噻吩吡啶類P2Y12受體拮抗劑，因“阿司匹林抵抗”、“氯吡格雷抵抗”使得療效個體差異大；纖維蛋白原受體拮抗劑只能靜脈給藥，價格昂貴，依賴進口，且因阻斷血小板激活的最后共同通路，故出血副作用較大；西洛他唑尚未通過美國FDA審批用于中風(fēng)、冠心病，抗血栓療效不夠滿意。因此，很有必要研發(fā)療效更好、出血副作用更低、口服、靜脈給藥都有

3、效的抗血小板新藥用于中風(fēng)、冠心病的治療。
　　 作為臨床上中風(fēng)、冠心病治療的一個新的趨勢，將抗血小板藥二聯(lián)(阿斯匹林+P2Y12受體拮抗劑如氯吡格雷)或三聯(lián)用藥(阿斯匹林+P2Y12受體拮抗劑如氯吡格雷+磷酸二酯酶抑制劑如西洛他唑)，通過增加作用靶點增強抗血栓療效，維持療效的同時降低出血副作用，目前同時針對2個靶點的抗血小板藥物尚未報道。我們與北京化工大學(xué)合作，對臨床使用和正在研發(fā)的具有P2Y12受體拮抗作用的抗血小板藥進行結(jié)構(gòu)

4、改造，合成了一系列新的化合物，首次報道了一個具有全新作用機制(同時作用于P2Y12受體和磷酸二酯酶)的雙靶點抑制血小板功能的新化合物BF0801(丙酸2-(6-氨基-2-(丙基硫氧嘧啶)-嘌呤-9-羥基)-乙酯，propionicacid2-(6-amino-2-(propylthio)-purin-9-y1)-ethyl ester)。
　　 本項課題對BF0801抗血小板作用及機制進行了研究。我們發(fā)現(xiàn)：BF0801顯著抑制A

5、DP、2MeSADP、AYPGKF、SFLLRN和convulxin誘導(dǎo)的體外血小板聚集，但不影響血小板變形。BF0801協(xié)同增強P2Y12受體拮抗劑AR-C69931MX或磷酸二酯酶抑制劑IBMX對激動劑(AYPGKF、SFLLRN和convulxin)誘導(dǎo)的體外血小板聚集的抑制效果。我們通過環(huán)核苷酸水平測定實驗發(fā)現(xiàn)：BF0801提高靜息期血小板、forskolin處理后的血小板cAMP水平和硝普鈉處理后的血小板cGMP水平。通過體外

6、酶活性測定實驗發(fā)現(xiàn)：BF0801抑制血小板粗提物PDE酶及重組PDE酶活性。此外，和AR-C69931MX相似，BF0801顯著減弱2MeSADP通過P2Y12-Gi通路抑制腺苷酸環(huán)化酶的效果，提示其具有P2Y12拮抗作用。我們還通過原子力顯微鏡技術(shù)對ADP配體和P2Y12受體的相互作用力進行測定，發(fā)現(xiàn)BF0801顯著抑制ADP配體和P2Y12受體的相互作用力。最后，我們將BF0801尾靜脈注射注大鼠后，分離血小板，發(fā)現(xiàn)BF0801具有

7、較好抗血小板效果。
　　 綜上所述，我們首次報道了一個新的腺嘌呤衍生物BF0801，作為一種同時針對PDE和P2Y12雙靶點的新型抗血小板化合物，具備潛在的新藥開發(fā)應(yīng)用價值
　　 第二部分 P2Y12受體激活通過P13K-Akt途徑抑制Bak/Bax激活對抗血小板凋亡
　　 血小板是脫落自巨核細胞的“無核碎片”，人體內(nèi)的平均壽命為7-10天。在各種生理和病理性刺激物的作用下，血小板能夠被激活，經(jīng)歷粘附、變形、聚集

8、、顆粒釋放和血栓素A2合成等過程，在生理性止血和病理性血栓形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。凋亡又被稱為程序性細胞死亡，其特征主要包括核皺縮和細胞碎裂，過去一直認為凋亡是有核細胞的特征性現(xiàn)象。近來，越來越多的證據(jù)表明，盡管沒有細胞核，血小板也可以發(fā)生凋亡。在刺激物的作用下，血小板的凋亡事件與活化現(xiàn)象有很大的區(qū)別，最主要的凋亡事件包括：線粒體膜電位去極化、caspase-3激活、Bax和Bak活化、細胞色素C釋放等。血小板的凋亡參與其清除機制，決定

9、了血小板在血液循環(huán)中的生命周期。血液中的化學(xué)性刺激、高剪切力以及衰老過程，都會使血小板發(fā)生凋亡。增強的血小板凋亡參與了多種疾病的病理進程，包括免疫性血小板減少癥、巨血小板性血小板綜合癥、尿毒癥、Ⅱ型糖尿病以及幽門螺旋桿菌及痢原蟲的感染。研究表明，血小板的凋亡在生理或病理的生命過程中都扮演了重要角色。近10年來，已經(jīng)有70多篇關(guān)于血小板凋亡的現(xiàn)象和機制研究在國際刊物上發(fā)表。在與血小板活化有關(guān)的受體中，PAR1，GPⅠb和GPⅡbⅢa都已經(jīng)

10、被報道參與了血小板的凋亡進程。作為最為成功的抗血小板藥物靶點，P2Y12在血小板活化方面已經(jīng)有深入的研究，然而，P2Y12是否參與血小板的凋亡進程仍未見報道。
　　 在本研究中，我們利用ABT-737體外處理的人血小板、37℃體外儲存的人血小板、ABT-263體內(nèi)處理的小鼠血小板，探索了P2Y12在血小板凋亡中的作用和機制。我們發(fā)現(xiàn)，P2Y12激活可以拮抗血小板凋亡，其機制是通過PI3K途徑依賴性地抑制Bak/Bax激活，保護血