益氣活血中藥配伍聯(lián)合雙抗抗血小板的作用與機制研究.pdf

1、阿司匹林(Aspirin，ASA)和氯吡格雷(Clopidogrel，CLP)組成的雙聯(lián)抗血小板(Dual antiplatelet therapy)是急性冠脈綜合癥(Acute coronarysyndrome，ACS)患者經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)(Percutaneous coronary intervention，PCI)后一年內(nèi)的常規(guī)治療方案.
　　西洋參和三七配伍是益氣活血的常用配伍之一，被廣泛應(yīng)用于冠心病等血栓性疾病的治療。

2、既往研究證實，益氣活血中藥聯(lián)合雙抗和單用雙抗相比，可顯著降低PCI術(shù)后患者的血栓事件發(fā)生率，且不增加出血風險。西洋參莖葉總皂苷(Panax quinquefolium saponin，PQS)作為上市中成藥，在國內(nèi)用于冠心病治療近20年，臨床試驗證明，PQS可顯著減輕冠心病心絞痛癥狀和缺血心電圖改變。
　　三七總皂苷(Panax notoginseng saponin，PNS)可減輕內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷，抑制ADP或膠原誘導(dǎo)的血小

3、板活化。PNS聯(lián)合雙抗與單用雙抗相比，可以顯著降低PCI術(shù)后1年內(nèi)心血管事件發(fā)生率，但目前尚缺乏關(guān)于PNS與ASA在抗血小板方面的比較研究。既往研究證實PNS可上調(diào)入臍靜脈內(nèi)皮細胞(Humanumbilical vein endothelial cell，HUVEC)內(nèi)PI3K/Akt/GSK-3β通路蛋白表達，減輕細胞凋亡。PNS對雙抗誘導(dǎo)的胃粘膜上皮細胞凋亡和通透性升高有何作用，其機制是否也涉及PI3K/Akt/RhoA通路和COX

4、通路，以往尚缺乏研究。
　　圍繞以上問題，本研究提出如下假說:(1)在雙抗基礎(chǔ)上聯(lián)用PQS或PNS，可進一步抑制內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)的血小板粘附和活化;(2) PQS聯(lián)合雙抗可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路發(fā)揮內(nèi)皮細胞保護作用;(3) PNS可抑制內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)的血小板活化，機理可能涉及對內(nèi)皮細胞和血小板COX通路的抑制;(4) PNS通過調(diào)節(jié)胃粘膜上皮細胞COX/PGs、PI3K/Akt/RhoA和PI3K/Akt/GSK-3β通路，減輕雙

5、抗誘導(dǎo)的胃粘膜上皮細胞凋亡和通透性升高。針對以上假說，本研究進行三部分研究:
　　實驗一:益氣活血中藥有效部位聯(lián)合雙抗對內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)血小板粘附的影響
　　目的:觀察PQS+雙抗、PNS+雙抗及PQS與PNS配伍聯(lián)合雙抗對內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)的血小板粘附的作用，并從PI3K/Akt、COX-2/6-keto-PGF1α和COX-1/TXB2通路探討其機制。
　　方法:體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical ve

6、in endothelial cell，HUVEC)，加入氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)（終濃度:80mg/L）干預(yù)HUVEC16h，建立HUVEC損傷模型。損傷的HUVEC隨機分為模型組、雙抗組（ASA15μg/ml+氯吡格雷10μg/ml）、PQS(160μg/ml)+雙抗組，PNS(160μg/ml)+雙抗組，PQS(160μg/ml)+PNS(160μg/ml)

7、+雙抗組及PI3K特異性抑制劑(LY294002，30μ g/ml)+PQS+雙抗組，同時設(shè)空白組作為對照。
　　結(jié)果:與空白組比較，模型組HUVEC凋亡率、血小板粘附、血小板CD62p表達均升高(P＜0.05)，細胞培養(yǎng)上清液中6-keto-PGF1α濃度、TXB2濃度均升高(P＜0.05)，HUVEC中p-Akt蛋白表達降低、COX-2蛋白表達升高(P＜0.05)，血小板中p-Akt蛋白表達升高(P＜0.05)。與模型組比較，

8、雙抗組血小板粘附、血小板CD62p表達均降低(P＜0.05)，HUVEC凋亡率無顯著變化(P＞0.05)，細胞培養(yǎng)上清液中6-keto-PGF1α濃度、TXB2濃度均降低(P＜0.05)，HUVEC中COX-2蛋白表達降低(P＜0.05)，p-Akt蛋白表達無明顯變化(P＞0.05)，血小板中p-Akt蛋白表達降低(P＜0.05)。與雙抗組比較，PQS+雙抗組血小板粘附、HUVEC凋亡率均降低(P＜0.05)，血小板CD62p表達無明顯

9、變化(P＞0.05)，上清液6-keto-PGF1α濃度升高(P＜0.05)，HUVEC p-Akt蛋白表達升高(P＜0.05);加入LY294002后，HUVEC凋亡率、血小板粘附均升高(P＜0.05)。與雙抗組相比，PNS+雙抗組血小板粘附、HUVEC凋亡率均降低(P＜0.05)，血小板CD62P表達無明顯改變(P＞0.05)，上清液6-keto-PGF1α濃度升高(P＜0.05)，HUVEC中COX-2蛋白表達升高(P＜0.05)

10、，血小板COX-1蛋白表達降低(P＜0.05)。與PQS+雙抗組比較，PQS+PNS+雙抗組內(nèi)皮細胞凋亡率、血小板粘附和CD62p表達均降低(P＜0.05)，血小板COX-1蛋白表達降低(P＜0.05)。與PNS+雙抗組比較，PQS+PNS+雙抗組內(nèi)皮細胞凋亡率和血小板粘附均降低(P＜0.05)，CD62p表達無明顯改變(P＞0.05)。
　　結(jié)論:PQS聯(lián)合雙抗或PNS聯(lián)合雙抗均可抑制內(nèi)皮細胞凋亡和內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)的血小板粘附，PQ

11、S與PNS配伍聯(lián)合雙抗，效果更顯著，其機制涉及對內(nèi)皮細胞PI3K/Akt通路、COX-2/PGI2通路的促進和對血小板PI3K/Akt通路、COX-1/TXA2通路的抑制。
　　實驗二:三七總皂苷對內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)血小板粘附的作用與機制研究目的:觀察PNS和ASA對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡及凋亡內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)的血小板活化和粘附的作用，并從COX通路探討其機制。
　　方法:體外培養(yǎng)HUVEC，加入ox-LDL（終濃度:80mg

12、/L）干預(yù)HUVEC16h建立HUVEC損傷模型。損傷的HUVEC隨機分為模型組，ASA組(15μ g/ml)， PNS組(160μg/ml)，同時設(shè)置空白組作為對照。造模16h后，HUVEC中加入靜息血小板共同孵育5min。流式細胞術(shù)檢測HUVEC凋亡率、血小板粘附和血小板CD62p表達，放免法檢測細胞培養(yǎng)上清液6-keto-PGF1α和TXB2水平，Western-blot檢測HUVEC和血小板中COX-1、COX-2蛋白表達。

13、r>　　結(jié)果:與空白組相比，模型組HUVEC凋亡率、血小板粘附、血小板CD62p表達均顯著升高(P＜0.05)，細胞培養(yǎng)上清液6-keto-PGF1α和TXB2水平均升高(P＜0.05)。與模型組比較，ASA組HUVEC凋亡率升高，血小板粘附和血小板CD62p表達均降低(P＜0.05)，細胞培養(yǎng)上清液6-keto-PGF1α和TXB2水平均降低(P＜0.05)。與ASA組比較，PNS組HUVEC凋亡率和血小板粘附均顯著降低(P＜0.05

14、)，細胞培養(yǎng)上清液6-keto-PGF1α水平升高(P＜0.05)，TXB2水平降低(P＜0.05)， HUVEC中COX-2蛋白表達升高(P＞0.05)，血小板COX-1蛋白表達降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:ASA與PNS均可抑制內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)的血小板粘附與活化，其中與ASA相比，PNS抑制血小板粘附的作用更顯著，其機制涉及PNS對血小板COX-1/TXA2通路的抑制和對內(nèi)皮細胞COX-2/PGI2通路的促進作用。
　　

15、實驗三:三七總皂苷對雙抗引起的胃粘膜上皮細胞損傷的影響
　　目的:觀察PNS對雙抗誘導(dǎo)的胃粘膜上皮細胞凋亡和通透性升高的影響，并從COX通路和PI3K/Akt通路探討其作用機制。
　　方法:體外培養(yǎng)人胃粘膜上皮細胞（GES-1），隨機分為空白組、雙抗組、PNS+雙抗組、LY294002+PNS+雙抗組。流式細胞術(shù)檢測GES-1凋亡率，酶標儀測定GES-1細胞通透性，放免法檢測GES-1細胞培養(yǎng)上清液PGE2、6-keto-P

16、GF1α濃度，ELISA法檢測GES-1細胞培養(yǎng)上清液血管內(nèi)皮細胞生長因子(Vascular endothelialgrowth factor，VEGF)濃度。Western-blot檢測GES-1中COX-1、COX-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK-3β、RhoA、GTP-RhoA蛋白表達。
　　結(jié)果:與空白組比較，雙抗組GES-1凋亡率、通透性均顯著升高(P＜0.05)，PGE2、6-keto-PGF1

17、α和VEGF濃度均降低(P＜0.05)，COX-1、p-PI3K、p-Akt蛋白表達均降低(P＜0.05)，COX-2、GTP-RhoA、GSK-3β蛋白表達均升高(P＜0.05)。與雙抗組比較，PNS+雙抗組GES-1凋亡率與通透性均降低(P＜0.05)，PGE2、6-keto-PGF1α和VEGF濃度均升高(P＜0.05)，COX-1、p-PI3K、p-Akt蛋白表達均升高(P＜0.05)，COX-2、GTP-RhoA、GSK-3β