血管老化相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞衰老的機(jī)制研究與益氣活血中藥的干預(yù)作用.pdf

1、血管老化是促進(jìn)心血管疾病發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，隨著我國(guó)老齡化社會(huì)的到來(lái)，對(duì)其進(jìn)行深入的研究顯得十分必要。血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅是血液與血管平滑肌之間的一層半通透性屏障，亦是一個(gè)活躍的內(nèi)分泌器官，是全身和局部血流動(dòng)力學(xué)功能及細(xì)胞增生調(diào)節(jié)的重要決定因素。研究已經(jīng)表明，內(nèi)皮細(xì)胞衰老是血管整體老化的重要病理改變之一：因此，內(nèi)皮細(xì)胞一直是血管老化研究的重點(diǎn)領(lǐng)域。本課題組前期的相關(guān)研究取得了如下成果：AngⅡ的誘導(dǎo)從mRNA和蛋白水平上調(diào)AT1和NADPH

2、氧化酶p22phox的表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的增高，可能是血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的主要機(jī)制之一；氧化應(yīng)激在血管老化的發(fā)生、發(fā)展中有著重要的作用。同時(shí)，益氣活血中藥人參、三七、川芎組方能夠有效降低AngⅡ信號(hào)通路的強(qiáng)度，減輕氧化應(yīng)激損傷，具有顯著的延緩血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用；并且中藥低劑量干預(yù)(20mg/L)的療效更加突出。
　　增殖停滯被認(rèn)為是細(xì)胞衰老的重要特征。人體衰老時(shí)組織器官的結(jié)構(gòu)和功能退化均與其細(xì)胞數(shù)量的減少關(guān)系密切，而細(xì)胞

3、增殖則是維持細(xì)胞數(shù)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。衰老細(xì)胞的增殖障礙既受細(xì)胞外信號(hào)的調(diào)控，又必須通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的介導(dǎo)，而促使細(xì)胞周期的停滯。研究表明，細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子(CDI)的表達(dá)能夠明顯抑制細(xì)胞的增殖，是衰老細(xì)胞處理各種信息并作出相應(yīng)應(yīng)答的主要方式之一，這種控制生長(zhǎng)發(fā)育的基因在細(xì)胞生命晚期發(fā)揮作用可能是促使其衰老的主要原因。
　　過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是核受體超家族成員之一，其主要在脂肪組織、內(nèi)皮細(xì)胞以及

4、免疫細(xì)胞中表達(dá)，參與脂肪細(xì)胞分化、血管內(nèi)皮保護(hù)、及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等多項(xiàng)生命活動(dòng)，是胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥物作用的靶分子，是近年來(lái)心血管藥理研究的熱點(diǎn)之一?，F(xiàn)已表明，PPARγ可以直接作用于血管壁，阻斷血管硬化的進(jìn)程。同時(shí)，PPARγ辦能夠減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)其NO的合成與分泌，從而對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮重要的代償保護(hù)作用，并成為延緩血管老化和內(nèi)皮細(xì)胞衰老的重要作用靶點(diǎn)。
　　研究指出老化血管的結(jié)構(gòu)重塑和功能退化直接改變了

5、各種心血管疾病的發(fā)生閾值、進(jìn)展速度和嚴(yán)重程度，是導(dǎo)致心血管死亡率增高的主要原因之一。老化相關(guān)的血管硬化不同于局灶性的動(dòng)脈粥樣硬化，它不與臨床上的梗塞、出血和動(dòng)脈瘤等疾病直接相關(guān)，而表現(xiàn)為血管全程的管壁增厚、彈性降低和內(nèi)腔擴(kuò)大，與相關(guān)臟器的功能不全和衰竭關(guān)系更加密切。目前，評(píng)價(jià)血管老化程度最有臨床價(jià)值的無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)方法是測(cè)定脈搏波傳播速度(PWV)。血管老化促使血管壁增厚，僵硬度增加，順應(yīng)性降低，從而導(dǎo)致其PWV水平升高。國(guó)外研究指出，急性

6、心肌梗死患者的PWV水平與其心血管死亡率密切相關(guān)，并且獨(dú)立于先前的心血管疾病史、年齡和糖尿病等。
　　因此，在前期工作的基礎(chǔ)上，本研究旨在進(jìn)一步從內(nèi)皮細(xì)胞衰老的角度研究血管老化的發(fā)生機(jī)制和益氣活血中藥干預(yù)的作用途徑；并以STEMI為疾病平臺(tái)，探討血管老化的臨床意義和中醫(yī)舌象特征。首先，繼續(xù)以AngⅡ誘導(dǎo)的衰老血管內(nèi)皮細(xì)胞模型為研究對(duì)象，采用低劑量益氣活血中藥干預(yù)，以從細(xì)胞增殖調(diào)控的角度，探討其衰老的內(nèi)在機(jī)制和中藥的干預(yù)作用；其次，

7、以PPARγ為靶點(diǎn)，探討其對(duì)衰老內(nèi)皮細(xì)胞的代償保護(hù)作用及其變化，并揭示益氣活血中藥干預(yù)的可能機(jī)制。再次，以PWV為檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)血管老化與ST段抬高急性心肌梗死(STEMI)患者近期預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行分層分析，并從舌診的角度分析血管老化的中醫(yī)特征。以期為血管老化的研究及中醫(yī)藥防治提供新理論、新視角和新靶點(diǎn)，也為將來(lái)從血管老化角度評(píng)估心血管疾病的預(yù)后提供新的思路。
　　本論文主要由基礎(chǔ)研究、臨床研究和文獻(xiàn)綜述所組成。
　　基礎(chǔ)研究

8、分為以下四個(gè)部分：
　　第一部分：AngⅡ誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的特征改變
　　目的：探討AngⅡ誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的細(xì)胞學(xué)特征改變。
　　方法：從健康產(chǎn)婦分娩健康嬰兒的臍帶中分離、培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，作形態(tài)學(xué)和vWF熒光抗體染色鑒定，采用ECM完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)細(xì)胞至生長(zhǎng)良好的第4代，同步化后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為對(duì)照組和AngⅡ組(10-6mol/L)。選取AngⅡ誘導(dǎo)后的24h和48h點(diǎn)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，運(yùn)用

9、熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，采用β-半乳糖苷酶染色鑒定細(xì)胞的衰老，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO、eNOS的含量判斷內(nèi)皮細(xì)胞的功能狀態(tài)；利用CCK-8和流式細(xì)胞周期檢測(cè)評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，AngⅡ組隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，其細(xì)胞數(shù)量減少，胞漿區(qū)域增大，細(xì)胞漿/細(xì)胞核比例增加，胞漿中可見(jiàn)較多顆?；蚩张?；β-半乳糖苷酶陽(yáng)性染色的細(xì)胞數(shù)量明顯增加(p<0.01)；上清中NO和eNOS的含量明顯下降(p<0.01)；CC

10、K-8法檢測(cè)的活細(xì)胞數(shù)量明顯減少(p<0.01)；細(xì)胞大量停滯于G0/G1期，而S期和G2/M期逐漸消失(p<0.01)。AngⅡ組24h點(diǎn)與48h點(diǎn)比較，上述指標(biāo)均有顯著差異，48h點(diǎn)細(xì)胞的衰老特征更為明顯(p<0.05)。
　　結(jié)論：AngⅡ誘導(dǎo)產(chǎn)生的衰老血管內(nèi)皮細(xì)胞，其主要的細(xì)胞學(xué)特征包括功能障礙和增殖障礙。
　　第二部分：益氣活血中藥對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老特征的干預(yù)作用
　　目的：驗(yàn)證益氣活血中藥人參、三七、川芎組

11、方對(duì)衰老血管內(nèi)皮細(xì)胞的干預(yù)作用。
　　方法：體外培養(yǎng)HUVECs，采用AngⅡ(10-6mol/L)、中藥組方浸膏(20mg/L)和替米沙坦(10-6mol/L)干預(yù)，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、AngⅡ組(AngⅡ10-6mol/L)、中藥浸膏組(中藥20mg/L+AngⅡ10-6mol/L)和替米沙坦組(替米沙坦、AngⅡ10-6mol/L)。選取藥物干預(yù)后的24h和48h點(diǎn)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，采用MTT法檢測(cè)干預(yù)藥物的細(xì)胞毒性，通過(guò)β-半乳糖

12、苷酶染色、培養(yǎng)上清NO、eNOS含量測(cè)定、CCK-8和流式細(xì)胞周期分析對(duì)藥物的干預(yù)作用進(jìn)行觀察。
　　結(jié)果：實(shí)驗(yàn)濃度的中藥浸膏和替米沙坦對(duì)HUVECs無(wú)明顯毒性，細(xì)胞存活率均達(dá)97.0％以上。與AngⅡ組相比，在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，中藥組和替米沙坦組的β-半乳糖苷酶陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)均明顯下降(p<0.05)，細(xì)胞周期阻滯亦明顯改善(p<0.05)。在24h點(diǎn)，中藥組的NO、eNOS含量和CCK-8活細(xì)胞數(shù)量均明顯增加(p<0.05)，而在4

13、8h點(diǎn)，替米沙坦組的上述指標(biāo)增加明顯(p<0.05)。中藥組與替米沙坦組比較，在24h點(diǎn)，中藥組的各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于替米沙坦組(p<0.05)；而在48h點(diǎn)，替米沙坦組的各項(xiàng)指標(biāo)則較中藥組為優(yōu)(p<0.05)。
　　結(jié)論：益氣活血中藥人參、三七、川芎組方能夠有效延緩AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老，部分恢復(fù)其增殖能力與內(nèi)皮功能：并且中藥在細(xì)胞衰老早期的干預(yù)作用更加明顯。
　　第三部分：AngⅡ誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老p53、p16基因

14、表達(dá)及中藥干預(yù)的研究
　　目的：探討AngⅡ誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老相關(guān)基因p53、p16INK4a的表達(dá)與益氣活血中藥的干預(yù)作用，進(jìn)一步明確衰老內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖障礙的內(nèi)在機(jī)制。
　　方法：體外培養(yǎng)HUVECs，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、AngⅡ組(AngⅡ10-6mol/L)、中藥浸膏組(中藥20mg/L+AngⅡ10-6mol/L)和替米沙坦組(替米沙坦、AngⅡ10-6mol/L)。利用免疫化學(xué)染色法觀察AngⅡ誘導(dǎo)24h和48h細(xì)

15、胞p53、p16INK4a缸陽(yáng)性染色的情況；采用RT-PCR和Western-blot法分析各組細(xì)胞0、12h、24h、36h和48h的p53、p16INK4a mRNA和蛋白表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。
　　結(jié)果：隨AngⅡ誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，48h時(shí)p53、p16INK4a陽(yáng)性染色的細(xì)胞數(shù)量較之24h明顯增加，染色程度亦明顯加深。AngⅡ呈時(shí)間依賴性上調(diào)p53、p16INK4a的mRNA和蛋白表達(dá)，其中p53的表達(dá)早于p16INK4a。中

16、藥和替米沙坦干預(yù)后，兩組的p53、p16INK4a表達(dá)較之AngⅡ組均明顯下調(diào)(p<0.05)；中藥組與替米沙坦組比較，在24h點(diǎn)，中藥抑制p53表達(dá)的作用更加明顯(p<0.05)，而兩者對(duì)p16INK4a表達(dá)的影響則無(wú)明顯差異(p>0.05)；在48h點(diǎn)，替米沙坦對(duì)p53和p16INK4a表達(dá)的抑制作用均優(yōu)于中藥(p<0.05)。
　　結(jié)論：衰老血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖障礙可能源于CDI基因p53、p16INK4a的異常表達(dá)上調(diào)；益氣

17、活血中藥能夠明顯抑制CDI基因的表達(dá)，改善衰老細(xì)胞的增殖障礙，并且在衰老早期的作用更加明顯。
　　第四部分：AngⅡ誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老PPARγ基因的表達(dá)變化與中藥干預(yù)的可能機(jī)制
　　目的：探討PPARγ基因?qū)λダ涎軆?nèi)皮細(xì)胞的代償保護(hù)作用及其動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)一步明確益氣活血中藥干預(yù)的可能機(jī)制。
　　方法：體外培養(yǎng)HUVECs，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、AngⅡ組(10-6mol/L)、中藥浸膏組(中藥20mg/L+AngⅡ10-

18、6mol/L)、替米沙坦組(替米沙坦、AngⅡ10-6mol/L)、單純阻斷劑組(AngⅡ10-6mol/L+GW966210-5mol/L)和中藥加阻斷劑組(中藥20mg/L+AngⅡ10-6mol/L+GW966210-5mol/L)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別采用RT-PCR和Western-blot法分析各組細(xì)胞0、12h、24h、36h和48h的PPARγ、p53、p16INK4a mRNA和蛋白表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。
　　結(jié)果：

19、AngⅡ呈時(shí)間依賴性上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞的PPARγ mRNA表達(dá)；但其蛋白表達(dá)呈現(xiàn)出早升后降的趨勢(shì)，從0點(diǎn)到24h表達(dá)逐漸上調(diào)，24h達(dá)高峰，從24h到48h表達(dá)逐漸下調(diào)；各時(shí)間點(diǎn)，中藥組和替米沙坦組PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于AngⅡ組(p<0.05)；其中，中藥組在24h點(diǎn)的作用明顯優(yōu)于替米沙坦組(p<0.05)；而在36h和48h點(diǎn)，替米沙坦組的療效優(yōu)于中藥組(p<0.05)。對(duì)單純阻斷劑組和AngⅡ組的p53、p16INK

20、4a表達(dá)進(jìn)行比較，前者各時(shí)間點(diǎn)的p53、p16INK4a表達(dá)均高于后者(p<0.05)，說(shuō)明PPARγ對(duì)CDI基因具有調(diào)節(jié)作用。又通過(guò)對(duì)AngⅡ組、中藥浸膏組和中藥加阻斷劑組p53、p16INK4a表達(dá)的比較，發(fā)現(xiàn)在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，中藥加阻斷劑組的p53、p16INK4a表達(dá)明顯高于中藥組(p<0.05)，而低于AngⅡ組(p<0.05)；說(shuō)明中藥的作用與PPARγ信號(hào)通路有關(guān)。
　　結(jié)論：PPARγ對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老具有代償保護(hù)的作

21、用，除外抗氧化應(yīng)激和促進(jìn)NO合成，其亦能改善細(xì)胞的增殖障礙，機(jī)制可能與下調(diào)p53、p16的表達(dá)有關(guān)；在細(xì)胞衰老的晚期，PPARγ的作用降低與其翻譯障礙有關(guān)。益氣活血中藥能夠促進(jìn)PPARγ的表達(dá)，改善其翻譯障礙，并且部分依賴PPARγ信號(hào)通路的激活以實(shí)現(xiàn)延緩血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用。
　　臨床研究分為以下兩個(gè)部分：
　　第一部分：不同血管老化水平對(duì)ST段抬高急性心肌梗死患者近期預(yù)后的影響
　　目的：探討不同血管老化水平與S

22、T段抬高急性心肌梗死(STEMI)患者近期病死率和不良心血管事件發(fā)生率的相關(guān)性。
　　方法：選擇2005年至2008年間中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院心內(nèi)科和清華大學(xué)第一醫(yī)院心臟中心診治的STEMI患者282例為研究對(duì)象。入選病例均接受STEMI的常規(guī)治療，包括再灌注治療和全面藥物治療，病例信息記錄完整。所有患者均在STEMI發(fā)病后30天內(nèi)進(jìn)行過(guò)臂踝脈搏波速度(baPWV)檢測(cè)。按照不同的baPWV水平分為4組，即PWV正常組(<1400

23、cm/s)、PWV輕度升高組(PWV：1400-1900cm/s)、PWV中度升高組(PWV：1901-2400cm/s)和PWV重度升高組(PWV>2400cm/s)。分析不同PWV水平患者30天死亡、復(fù)發(fā)性心肌缺血、再次心肌梗死(再梗)、卒中、心源性休克以及包括上述事件的聯(lián)合終點(diǎn)事件發(fā)生情況。
　　結(jié)果：?jiǎn)我蛩胤治鲲@示，患者的30天病死率、聯(lián)合終點(diǎn)事件發(fā)生率隨著PWV水平升高而逐漸增高；30天病死率的各組比較無(wú)顯著差異(p>0

24、.05)，PWV正常組為最低(2.5％)，PWV重度升高組為最高(13.0％)；30天聯(lián)合終點(diǎn)事件發(fā)生率的各組比較差異顯著(p<0.01)，PWV正常組的發(fā)生率仍為最低(2.5％)，而PWV重度升高組的發(fā)生率仍為最高(19.6％)。多因素logistic回歸分析顯示，PWV的中度和重度升高是STEMI患者30天死亡的獨(dú)立相關(guān)因素，PWV重度升高患者的死亡危險(xiǎn)較之正常者增加9倍以上(p=0.021，OR：9.242)；PWV的中度和重度升

25、高辦是STEMI患者30天發(fā)生聯(lián)合終點(diǎn)事件的獨(dú)立相關(guān)因素，PWV重度升高組30天聯(lián)合終點(diǎn)事件的發(fā)生危險(xiǎn)較之正常組增加5倍以上(p=0.014，OR：5.932)。
　　結(jié)論：PWV>1900cm/s能夠顯著增加STEMI患者30天的病死率和聯(lián)合終點(diǎn)事件發(fā)生率；血管老化是STEMI患者近期不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　第二部分：STEMI患者不同血管老化水平與紫暗舌的相關(guān)性研究
　　目的：探討STEMI患者不同血管老化水

26、平與出現(xiàn)紫暗舌的相關(guān)性，揭示血管老化的中醫(yī)舌象特征。
　　方法：病例選擇與分組同第一部分。所有患者均從入院即刻開(kāi)始，進(jìn)行過(guò)連續(xù)的舌象采集和判斷，一天一次，共7天。紫暗舌的鑒定綜合中醫(yī)舌診圖像分析系統(tǒng)和專家舌診的結(jié)果共同作出。分析不同血管老化水平患者入院即刻、連續(xù)3天和連續(xù)7天紫暗舌的發(fā)生情況。
　　結(jié)果：?jiǎn)我蛩胤治鲲@示，患者入院即刻紫暗舌的出現(xiàn)率，各組未見(jiàn)明顯差異(p>0.05)；連續(xù)3天紫暗舌的出現(xiàn)率，各組差異明顯(p<0

27、.001)，PWV正常組為最低(44.3％)，PWV重度升高組為最高(87.0％)；連續(xù)7天紫暗舌的發(fā)生率，各組亦有顯著差異(p<0.001)，PWV正常組仍為最低(6.3％)，PWV重度升高組仍為最高(45.7％)。多因素logistic回歸分析顯示，PWV的中度和重度升高與STEMI患者連續(xù)7天出現(xiàn)紫暗舌的發(fā)生率具有獨(dú)立相關(guān)性，PWV重度升高組連續(xù)7天出現(xiàn)紫暗舌的發(fā)生率較之正常組增加49.7％(p<0.01，OR：1.497)。

28、r>　　結(jié)論：PWV>1900 cm/s能夠顯著增加STEMI患者連續(xù)7天出現(xiàn)紫暗舌的發(fā)生率，二者具有獨(dú)立的相關(guān)性；STEMI患者連續(xù)出現(xiàn)紫暗舌可能是血管老化的中醫(yī)證候特征。
　　文獻(xiàn)綜述分別就血管老化的研究進(jìn)展及中醫(yī)認(rèn)識(shí)，與PPARγ、p53、p16對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的調(diào)節(jié)作用兩個(gè)方面進(jìn)行了詳細(xì)闡述。
　　綜上所述，本研究分別從基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床觀察兩個(gè)方面對(duì)血管老化的發(fā)生機(jī)制、中醫(yī)藥防治靶點(diǎn)、臨床意義以及中醫(yī)舌象特征進(jìn)行了深

29、入的探討。其中，基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)著重研究了血管老化相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞衰老的機(jī)制與益氣活血中藥的干預(yù)作用及途徑。結(jié)果表明：衰老血管內(nèi)皮細(xì)胞具有功能障礙和增殖障礙的特征；其增殖障礙主要源于CDI基因p53、p16的異常高表達(dá)；PPARγ是細(xì)胞衰老的重要代償因子，但隨著衰老的進(jìn)展，由于蛋白的翻譯障礙，致使其保護(hù)效應(yīng)逐漸減弱。益氣活血中藥干預(yù)能夠明顯延緩血管內(nèi)皮細(xì)胞的衰老，不僅抑制p53、p16的表達(dá)，也增加PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)，改善其翻譯障礙。同

30、時(shí)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響，除了抗氧化應(yīng)激和促進(jìn)NO合成之外，還與抑制p53、p16的表達(dá)有關(guān)；并且益氣活血中藥的干預(yù)作用，可能部分通過(guò)激活PPARγ信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)。不僅如此，研究還提示益氣活血中藥的作用在細(xì)胞衰老過(guò)程的早期更為明顯，可能對(duì)于血管老化的預(yù)防意義更大。本論文的臨床研究則初步顯示了血管老化與心血管疾病不良預(yù)后的相關(guān)性，并認(rèn)為紫暗舌可能是血管老化的中醫(yī)證候特征之一?？傊狙芯康膭?chuàng)新之處在于，從內(nèi)皮細(xì)胞的增