靜脈表型分子COUP-TFⅡ調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用及機(jī)制.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化是造成心腦血管疾病和外周血管病的重要原因，是現(xiàn)代社會(huì)致死，致殘，嚴(yán)重影響人類健康和生活質(zhì)量的主要因素之一。動(dòng)脈粥樣硬化好發(fā)于動(dòng)脈，靜脈與動(dòng)脈同處于一個(gè)血管系統(tǒng)中，然而靜脈卻未見(jiàn)粥樣硬化。雖然與血流動(dòng)力學(xué)等因素有關(guān)，但靜脈和動(dòng)脈本身分子表型就不同，目前尚不清楚動(dòng)靜脈對(duì)粥樣硬化易感性的差異，除受血流動(dòng)力學(xué)等環(huán)境因素影響外，是否還與血管本身分子表型有關(guān)。
　　目的：
　　本研究旨在觀察特異表達(dá)于靜脈內(nèi)皮的COUP-TF

2、Ⅱ?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞衰老和增殖的影響及可能的信號(hào)和分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAEC)，采用PCR方法檢測(cè)COUP-TFⅡ基因在離體HUVEC和HCAEC的表達(dá)水平的差異。
　　2.通過(guò)轉(zhuǎn)染COUP-TFⅡ-siRNA使HUVEC的COUP-TFⅡ表達(dá)降低，觀察COUP-TFⅡ?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞衰老增殖的影響。AngⅡ(10-5 mol/L)誘導(dǎo)48小時(shí)后，利用β

3、-半乳糖苷酶(β-gal)細(xì)胞染色，熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)和Western blot檢測(cè)衰老相關(guān)基因P53的蛋白表達(dá)情況，觀察COUP-TFⅡ?qū)UVEC衰老的影響。利用CCK-8和細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)HUVEC的增殖情況。
　　3.為了進(jìn)一步探究Akt信號(hào)對(duì)COUP-TFⅡ調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響，利用Western blot檢測(cè)了Akt/p-Akt的蛋白表達(dá)變化情況;加入Akt激動(dòng)劑SC79后，用β-ga

4、l細(xì)胞染色和熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的方法檢測(cè)HUVEC的衰老率、Western blot檢測(cè)衰老相關(guān)基因P53的蛋白表達(dá)變化情況;用CCK-8法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)HUVEC增殖的變化情況，觀察Akt信號(hào)與COUP-TFⅡ?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞衰老和增殖影響的可能機(jī)制。
　　4.為了進(jìn)一步探究胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1(IGFBP-1)對(duì)COUP-TFⅡ調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響，利用Western blot檢測(cè)了IGFBP-

5、1的蛋白表達(dá)變化情況;加入IGFBP-1蛋白后，用β-gal細(xì)胞染色和熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的方法檢測(cè)HUVEC的衰老率、Western blot檢測(cè)衰老相關(guān)基因P53的蛋白表達(dá)變化情況;用CCK-8法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)HUVEC增殖的變化情況，觀察IGFBP-1分子與COUP-TFⅡ?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞衰老和增殖影響的可能機(jī)制。
　　5.利用microRNA(miRNA)芯片技術(shù)探究COUP-TFⅡ?qū)iRNA表達(dá)譜的調(diào)

6、控影響。在無(wú)AngⅡ誘導(dǎo)下，分別提取3個(gè)Control組和si-COUP-TFⅡ組細(xì)胞樣本的RNA后，由華大基因公司進(jìn)行miRNA OneArray(@)芯片檢測(cè)及分析。
　　結(jié)果：
　　1.與Control組相比，通過(guò)COUP-TFⅡ小干擾RNA轉(zhuǎn)染降低HUVEC細(xì)胞COUP-TFⅡ表達(dá)后，能夠顯著促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老:我們分別檢測(cè)了內(nèi)皮細(xì)胞β-gal細(xì)胞染色的陽(yáng)性細(xì)胞率、熒光探針DCFH-DA的ROS陽(yáng)性細(xì)胞率

7、和Western blot的P53蛋白表達(dá)。在AngⅡ?yàn)? mol/L時(shí)，發(fā)現(xiàn)與Control組相比，si-COUP-TFⅡ組β-gal染色陽(yáng)性率（0.0622±0.0192vs0.0665±0.0132;P＞0.05）、ROS陽(yáng)性細(xì)胞率(0.0931±0.0111vs0.1120±0.0125; P＞0.05)、P53蛋白表達(dá)（1.0000±0.0544vs0.9870±0.0794;P＞0.05）均無(wú)顯著差異;在AngⅡ?yàn)?0-5m

8、ol/L時(shí)，發(fā)現(xiàn)與Control組相比，si-COUP-TFⅡ組β-gal染色陽(yáng)性率增高(0.4390±0.0673 vs0.8107±0.0452;P＜0.05)、ROS陽(yáng)性細(xì)胞率增高(0.1536±0.0145 vs0.3306±0.0532; P＜0.05)、P53蛋白表達(dá)增高(1.0000±0.0956 vs1.4142±0.0633; P＜0.05)。
　　2.與Control組相比，通過(guò)COUP-TFⅡ小干擾RNA轉(zhuǎn)染

9、降低HUVEC細(xì)胞COUP-TFⅡ表達(dá)后，能夠顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖:我們分別檢測(cè)了內(nèi)皮細(xì)胞在450nm的相對(duì)OD值和細(xì)胞計(jì)數(shù)值。在AngⅡ?yàn)? mol/L時(shí)，發(fā)現(xiàn)與Control組相比，si-COUP-TFⅡ組的相對(duì)OD值(1.0000±0.0272vs0.9839±0.0315; P＞0.05)、細(xì)胞計(jì)數(shù)值((1.0417±0.0892)×105 vs(1.0938±0.0970)×105, P＞0.05）均無(wú)顯著差異;

10、在AngⅡ?yàn)?0-5mol/L時(shí)，發(fā)現(xiàn)與Control組相比，si-COUP-TFⅡ組的相對(duì)OD值降低（1.0000±0.0808 vs0.5743±0.0567; P＜0.05）、細(xì)胞計(jì)數(shù)值降低（（3.5188±0.0963）×105vs(2.0875±0.0973)×105; P＜0.05)。
　　3.Akt激動(dòng)劑SC79(4ug/ml)能夠部分逆轉(zhuǎn)COUP-TFⅡ調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞衰老增殖的影響:我們分別檢測(cè)了內(nèi)皮細(xì)胞β-gal細(xì)

11、胞染色的陽(yáng)性細(xì)胞率、熒光探針DCFH-DA的ROS陽(yáng)性細(xì)胞率和Western blot的P53蛋白表達(dá)。在AngⅡ(10-5mol/L)刺激作用下，發(fā)現(xiàn)加入Akt激動(dòng)劑SC79后，si-COUP-TFⅡ+SC79組的β-gal染色陽(yáng)性率降低(0.4436±0.0488 vs0.7558±0.0667 vs0.5154±0.0213; P＜0.05)、 ROS陽(yáng)性細(xì)胞率降低(0.1325±0.0221 vs0.3404±0.0383 vs

12、0.2133±0.0205, P＜0.05)、 P53蛋白表達(dá)降低(1.0000±0.0665 vs1.4985±0.0710 vs1.0818±0.0603;P＜0.05);檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞在450nm的相對(duì)OD值和細(xì)胞計(jì)數(shù)值，在AngⅡ(10-5mol/L)刺激作用下，發(fā)現(xiàn)加入Akt激動(dòng)劑SC79后，si-COUP-TFⅡ+SC79組的相對(duì)OD值增高(1.0000±0.0613 vs0.5940±0.0296vs0.8250±0.038

13、5; P＜0.05)、細(xì)胞計(jì)數(shù)值增高（（4.3667±0.0933）×105 vs(1.6417±0.0969×105 vs(2.6958±0.0966)×105, P＜0.05)。
　　4.IGFBP-1(100ng/ml)蛋白能夠部分逆轉(zhuǎn)COUP-TFⅡ調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞衰老增殖的影響:我們分別檢測(cè)了內(nèi)皮細(xì)胞β-gal細(xì)胞染色的陽(yáng)性細(xì)胞率、熒光探針DCFH-DA的ROS陽(yáng)性細(xì)胞率和Western blot的P53蛋白表達(dá)。在AngⅡ

14、(10-5mol/L)刺激作用下，發(fā)現(xiàn)加入IGFBP-1蛋白后，si-COUP-TFⅡ+IGFBP-1組的β-gal染色陽(yáng)性率降低(0.2121±0.0412 vs0.6423±0.0286 vs0.2616±0.0318; P＜0.05)、 ROS陽(yáng)性細(xì)胞率降低(0.1382±0.0110 vs0.3357±0.0242 vs0.2620±0.0379,P＜0.05)、 P53蛋白表達(dá)降低(1.0000±0.1018 vs1.4626

15、±0.0459 vs1.1167±0.0481; P＜0.05);檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞在450nm的相對(duì)OD值和細(xì)胞計(jì)數(shù)值，在AngⅡ(10-5mol/L)刺激作用下，發(fā)現(xiàn)加入IGFBP-1蛋白后，si-COUP-TFⅡ+IGFBP-1組的相對(duì)OD值增高(1.0000±0.0717 vs0.6051±0.0626vs0.9058±0.0607; P＜0.05)、細(xì)胞計(jì)數(shù)值增高((4.4667±0.0707)×105 vs(2.1583±0.09

16、05)×105vs(3.6271±0.0898)×105, P＜0.05)。
　　5.抑制內(nèi)皮細(xì)胞COUP-TFⅡ的表達(dá)后，共有27個(gè)miRNAs發(fā)生了顯著的差異表達(dá)，其中表達(dá)上調(diào)的有21個(gè)miRNAs，而表達(dá)下調(diào)的有6個(gè)miRNAs。在這些差異變化的miRNAs中，miR-642a-3p與脂質(zhì)代謝有關(guān);miR-513a-5p、miR-130a-3p、miR-221-3p和miR-652與炎癥反應(yīng)有關(guān);而miR-196a、miR-

17、1247、miR-92b和miR-363-5p與細(xì)胞增殖有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.抑制靜脈內(nèi)皮表型分子COUP-TFⅡ表達(dá)時(shí)，能促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)的靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老、抑制其增殖，提示COUP-TFⅡ?qū)?nèi)皮細(xì)胞衰老具有保護(hù)作用，其分子機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)Akt信號(hào)和IGFBP-1分子的表達(dá)有關(guān)。
　　2.抑制COUP-TFⅡ表達(dá)能改變靜脈內(nèi)皮miRNAs的表達(dá)譜，主要涉及炎癥、脂質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖等方面，提示COUP-TFⅡ可