膽固醇致人血管內(nèi)皮細(xì)胞DNA損傷的分子機制.pdf

1、目的:研究膽固醇誘導(dǎo)HUVECs中ROS升高引起的DNA損傷的機制:轉(zhuǎn)錄因子MCPIP是否介導(dǎo)？通過什么方式介導(dǎo)？以進一步認(rèn)識脂代謝異常、DNA損傷與As關(guān)系。
　　 方法:1、培養(yǎng)并鑒定人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。2、Real-time PCR及Western blot檢測膽固醇對HUVECs中MCPIP mRNA及蛋白表達(dá)的劑效、時效影響。3、用瞬時轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染MCPIPsiRNA，沉默HUVEC中MCPIP基因，Real-time

2、PCR及Western blot檢測MCPIPmRNA及蛋白水平以確定基因沉默效率。4、免疫熒光檢測γ-H2AX焦點形成;Western blot檢測γ-H2AX蛋白水平，確定細(xì)胞DNA損傷情況。5、單細(xì)胞凝膠電泳檢測細(xì)胞DNA損傷情況。6、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞ROS的生成量。7、Western blot檢測Nox4、p47phox的表達(dá)及膜上p47phox蛋白的表達(dá)情況。8、免疫組化檢測As模型鼠胸主動脈γ-H2AX蛋白表達(dá)。
　

3、　 結(jié)果:1、成功培養(yǎng)了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)免疫熒光鑒定證明該細(xì)胞株為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株。2、不同劑量組膽固醇作用HUVECs24h后，結(jié)果顯示膽固醇濃度≥6.25mg/L的各劑量組與對照組相比MCPIP mRNA的轉(zhuǎn)錄升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01);12.5mg/L膽固醇作用不同時間發(fā)現(xiàn)MCPIP mRNA的表達(dá)量在2h之前有較低水平的波動，分別于0.5h及2h表達(dá)量最低，之后隨時間的增加表達(dá)量逐漸增多，與對

4、照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。MCPIP蛋白表達(dá)的劑效和時效關(guān)系與MCPIP mRNA的表達(dá)趨勢基本一致。3、用瞬時轉(zhuǎn)染方法將si-MCPIP轉(zhuǎn)染HUVEC，MCPIPmRNA及蛋白水平沉默效率分別為73.4％(p＜0.01)、41.1％(p＜0.05)。4、免疫熒光檢測結(jié)果顯示膽固醇作用組γH2AX焦點形成的陽性細(xì)胞率和發(fā)生頻率較對照組增加，si-MCPIP+膽固醇組結(jié)果較膽固醇作用組降低(p＜0.01)。5、膽固醇作用

5、組γH2AX水平增加，si-MCPIP+膽固醇組γH2AX水平與膽固醇作用組相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。6、CASP分析單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果表明膽固醇作用組細(xì)胞TM值較對照組增加，si-MCPIP+膽固醇組細(xì)胞TM值減低，與膽固醇作用組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。7、膽固醇作用組較對照組相比細(xì)胞ROS的生成量增加，si-MCPIP+膽固醇組細(xì)胞ROS的生成量與膽固醇作用組相比減少(p＜0.05)。8、膽固

6、醇作用組較對照組相比Nox4、p47phox的表達(dá)增高，膜上p47phox蛋白水平升高;si-MCPIP+膽固醇組Nox4、p47phox的表達(dá)降低(p＜0.05)，膜上p47phox蛋白水平減少，與膽固醇作用組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。9、免疫組化檢測As模型鼠胸主動脈與正常喂飼的對照組比較，γ-H2AX蛋白表達(dá)增加(p＜0.01)。
　　 結(jié)論:1、膽固醇誘導(dǎo)了HUVECs中MCPIP的表達(dá)。2、 MCPIP通過誘導(dǎo)Nox4和