多壁納米碳圈對人血管內皮細胞的DNA損傷及其機制研究.pdf

1、[目的] 隨著納米技術的迅速發(fā)展及納米材料的大量增多,納米技術的安全性問題正引起世界范圍的重點關注.多壁納米碳圈(MWCNO)是富勒烯(C60)的同素異形體,又稱為嵌套的富勒烯(nested fullerenes).本實驗使用的MWCNO是由電弧法制備的直徑在30nm左右納米材料.有研究表明碳納米顆粒進入肺部后能轉移到心血管系統(tǒng),同時有人試圖將其用作抗腫瘤等藥物的載體,進入血液后可直接接觸并作用于心血管系統(tǒng),因此其安全性研究顯得

2、特別重要.FrankChen等已就MWCNO對人皮膚成纖維細胞的細胞毒性和基因組學水平的影響進行研究,結果表明MWCNO可引起一系列與細胞代謝、凋亡、細胞周期、應激反應、細胞信號轉導和炎癥反應相關基因的mRNA水平的改變.但至今未見MWCNO對心血管系統(tǒng)影響的研究報道. 磷酸化的組蛋白H2AX(γH2AX)是目前國內外研究細胞DNA損傷的熱點之一,γH2Ax在DNA損傷的修復以及DNA損傷位點檢查點蛋白的聚集中發(fā)揮著重要的作用,特別是D

3、NA雙鏈的損傷.許多與染色體結構的維持、保護、修復相關的蛋白質有組織按順序地在DNA損傷位點結合形成焦點(foci)復合物,共同完成對DNA損傷的檢測和修復,并且在此過程中根據(jù)損傷程度的不同導致細胞周期停頓或細胞凋亡.因此,根據(jù)細胞在受到DNA損傷尤其是DNA雙鏈斷裂損傷后,在DSBs位點會出現(xiàn)由γH2AX形成的焦點這一特性,γH2Ax已成為檢測細胞DNA損傷的一個新的特異性指標. 體內外研究發(fā)現(xiàn)多種納米顆?？梢砸饳C體產生RO

4、S.目前許多空氣顆粒物(主要為PM<,2.5>、PM<,10>)和超微顆粒(UFPs)造成DNA損傷的研究都集中在氧化應激誘導的機制,認為DNA是ROS的主要靶點,ROS的產生是空氣中顆粒物質引起DNA損傷的重要機制. 本研究觀察MWCNO是否引起血管內皮細胞凋亡、細胞周期改變、DNA損傷及其損傷機制,以評價MWCNO潛在的心血管毒性. [方法] 采用體外實驗的方法.用臺盼藍染色法觀察不同濃度(0.2、1、5、2

5、5、50、100、200μg/ml)的MWCNO對人血管內皮細胞(HuvEC)的抑制率,根據(jù)確定的半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)設定本實驗的劑量.用檢測細胞周期、凋亡的試劑盒檢測不同濃度(0.2、1、5 ug/ml)的MWCNO染塵后血管內皮細胞的細胞周期和凋亡的變化情況.用免疫熒光法觀察不同劑量(同上)的MWCNO染塵后血管內皮細胞中磷酸化組蛋白H2AX(γH2AX)焦點形成情況,比較細胞核內焦點形成的數(shù)量及熒光強度.用DCFH-DA

6、法檢測不同劑量(同上)的MWCNO染塵后血管內皮細胞內ROS水平的變化情況.免疫熒光顯微鏡圖片用Image Pro Plus軟件進行γH2AX焦點定量計數(shù).所有結果采用SPSS統(tǒng)計軟件分析. [結果] 流式細胞儀凋亡檢測顯示:1、5μg/ml的MWCNO顯著促進了HUVECs細胞的凋亡,凋亡率與對照組比較有顯著性差異.細胞周期檢測顯示,各濃度MWCNO作用后均未引起明顯的細胞周期改變,G1、G2、S期細胞比例與對照組比較

7、均無顯著性差異.γH2AX識別抗體免疫熒光技術檢測了MWCNO對HUVECs細胞DNA雙鏈損傷的情況,結果發(fā)現(xiàn).MWCNO能誘導γH2AX焦點形成,并具有劑量和時問依賴性,高濃度(5μg/ml)MWCNO誘導的γH2AX焦點數(shù)目最多,熒光強度也最強,隨著時問延長γyH2AX焦點的數(shù)量及強度也隨之增多、增強.各濃度MWCNO處理的HUVECs細胞12h后可引起細胞內ROS水平升高,各處理組與對照組的差異有統(tǒng)計學意義,處理24h后ROS有所