唑來膦酸對血管內(nèi)皮細胞損傷的影響.pdf

1、目的：
　　雙膦酸鹽是目前臨床上用于治療骨源性惡性腫瘤的一線化療藥物。近年來，隨著這類藥物的廣泛使用，有關(guān)其并發(fā)癥的報道，特別是用于化療時導(dǎo)致下頜骨壞死的病例時有報道。目前雙膦酸鹽頜骨壞死(bisphosphonate-relatedosteonecrosis of the jaw bone，BRONJ)的發(fā)生機制尚不清楚，這已成為制約雙膦酸鹽藥物臨床應(yīng)用的重要問題。血管的損傷與其他部位骨壞死之間的關(guān)系一直受到學(xué)者們的關(guān)注，提出了

2、微血管損傷學(xué)說。本實驗通過檢測臨床上常用的且易引起B(yǎng)RONJ的一類雙膦酸鹽藥物唑來膦酸(zoledronate，ZOL)對血管重要構(gòu)成細胞血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)損傷的影響，從細胞角度探討雙膦酸鹽對血管的損傷和引起頜骨壞死的可能機制。
　　方法：
　　本實驗使用ZOL刺激HUVEC建立雙膦酸鹽對血管細胞損傷影響模型，并檢測與血管再生相關(guān)的細胞增殖、

3、遷移和黏附功能與血管損害相關(guān)的細胞凋亡過程的變化，而反映雙膦酸鹽對血管的損傷情況。人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞按標(biāo)準(zhǔn)細胞培養(yǎng)程序進行培養(yǎng)。ZOL粉劑用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)溶解，用前按實驗要求調(diào)配至所需濃度并過濾除菌。在HUVEC狀態(tài)良好時進行實驗，實驗設(shè)置實驗組（使用不同濃度ZOL藥物刺激）和對照組（不使用ZOL刺激）。在倒置顯微鏡下觀察24小時后實驗組與對照組細胞形態(tài)情況并拍攝照片記錄結(jié)果，從

4、細胞表面形態(tài)變化觀察ZOL對HUVEC的影響，使用MTT實驗、細胞遷移實驗、細胞黏附實驗、流式細胞周期實驗、流式細胞凋亡實驗分別檢測ZOL對HUVEC活性、遷移、黏附、增殖和凋亡的影響，western blot實驗從蛋白分子水平分別檢測ZOL對HUVEC增殖、遷移、黏附和凋亡的影響，比較實驗組與對照組實驗結(jié)果。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，實驗結(jié)果用統(tǒng)計產(chǎn)品與服務(wù)解決方案軟件(StatisticalProduct and Service S

5、olutions，SPSS，美國)進行統(tǒng)計學(xué)分析。使用t檢驗比較空白對照組與各濃度組之間差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義，以雙側(cè)P＜O.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　?、亠@微鏡下觀察可見在ZOL作用下細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞皺縮、形態(tài)多樣、邊緣粗糙、呈細枝狀伸出、隨著濃度的升高變化更為顯著，死亡細胞明顯增多。
　?、贛TT實驗中，與空白對照組相比，實驗組吸光度值（A值）明顯減小。且隨著藥物濃度升高，A值依次減小。IC50值

6、為629.8×10-7 mol/L。說明ZOL抑制HUVEC細胞活性，且在一定濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。
　?、奂毎w移實驗中，與空白對照組相比，實驗組細胞遷移距離降低，且隨著用藥濃度的升高，細胞的遷移距離依次下降。表明ZOL抑制HUVEC的遷移，且在一定濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。
　　④細胞黏附實驗中，與空白對照組相比，低、中、高濃度組吸光度降低，且隨著藥物濃度升高，細胞A值依次減小。表明ZOL抑制HUVEC的黏附隨藥物作用濃度升

7、高，抑制作用也更為明顯。
　　⑤流式細胞周期實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，實驗組細胞細胞周期出現(xiàn)紊亂，S期細胞增多，而G2/M期細胞數(shù)減少，且在一定濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。表明ZOL抑制細胞增殖。
　?、蘖魇郊毎蛲鰧嶒灲Y(jié)果顯示，與空白對照組相比，實驗組細胞早期凋亡數(shù)目明顯升高，并且隨著藥物濃度升高，細胞凋亡數(shù)目依次升高。表明ZOL促使細胞凋亡，且在一定濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。
　　⑦western blot實驗中，與空

8、白對照組相比，實驗組細胞內(nèi)與HUVEC增殖相關(guān)的蛋白P-ERK，與HUVEC黏附相關(guān)的蛋白VCAM-1，與HUVEC凋亡相關(guān)的蛋白P-AKT和Procaspase3顯著減少，表明ZOL抑制細胞增殖、黏附，促使細胞凋亡。而與HUVEC遷移相關(guān)的蛋白P-p38無顯著變化。
　　結(jié)論：
　?、俪晒OL損傷血管細胞模型。
　?、赯OL抑制HUVEC細胞增殖、遷移和黏附，說明ZOL抑制血管的再生。
　?、踆OL促使H