唑來膦酸抑制血管內(nèi)膜增生的實驗研究.pdf

1、目的：血管內(nèi)膜增生是血管重建術(shù)(血管移植、球囊血管成形術(shù)、支架植入術(shù)等)后常見而嚴(yán)重的并發(fā)癥，而常導(dǎo)致血管的再狹窄終致手術(shù)失敗。因此，探索有效抑制血管內(nèi)膜增生的藥物是解決問題的關(guān)鍵。前期研究表明二膦酸鹽能通過抑制、殺傷單核巨噬細(xì)胞以降低局部炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮抑制動脈粥樣硬化及血管內(nèi)膜增生的作用。二膦酸鹽能蓄積于人和動物的正常和粥樣硬化動脈中，這促使我們構(gòu)思并探索唑來膦酸(目前作用最強(qiáng)的二膦酸鹽)能否直接作用于血管壁中的主要細(xì)胞：血管平滑

2、肌細(xì)胞，以深化了解二膦酸鹽抑制血管內(nèi)膜增生的機(jī)制。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索唑來膦酸靜脈注射及局部應(yīng)用對血管內(nèi)膜增生的作用，以期為臨床治療血管內(nèi)膜增生開拓新思路和方法。
　　方法：(1)原代培養(yǎng)大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞并傳代：應(yīng)用細(xì)胞計數(shù)儀、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell技術(shù)、凋亡檢測、蛋白質(zhì)印跡等技術(shù)探索不同濃度唑來膦酸對血管平滑肌細(xì)胞的增殖、黏附和遷移的作用及其相關(guān)機(jī)制。光學(xué)顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察血管平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。

3、
　　(2)大鼠血管內(nèi)膜增生模型(球囊損傷頸動脈法)的建立：24只SD大鼠分為4組，每組6只，Ⅰ組為Ⅱ組為對照，僅行球囊損傷；Ⅱ組為球囊損傷+靜脈注射唑來膦酸(50μg/kg，1次/周)；Ⅲ組為Ⅳ組對照，為球囊損傷+血管外膜涂膠原；Ⅳ組為球囊損傷+血管外膜涂含唑來膦酸(100μM，200μL)的膠原。3周后應(yīng)用組織切片染色技術(shù)分析統(tǒng)計各組受損頸動脈的內(nèi)膜面積、中膜面積及內(nèi)膜/中膜面積比值。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法分析統(tǒng)計各組內(nèi)膜中增殖

4、細(xì)胞核抗原陽性細(xì)胞的比值，應(yīng)用透射電鏡觀察血管內(nèi)膜中平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　結(jié)果：(1)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果表明唑來膦酸對血管平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用隨藥物濃度的上升而增強(qiáng)，100μM唑來膦酸對血管平滑肌細(xì)胞增殖的抑制率達(dá)89.6％。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明唑來膦酸將血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于S/G2/M期，但未引起明顯的細(xì)胞壞死或凋亡。Transwell技術(shù)檢測結(jié)果表明唑來膦酸對血管平滑肌細(xì)胞的黏附及遷移均具有明顯的抑制作用，10

5、0μM唑來膦酸對血管平滑肌細(xì)胞的黏附和遷移的抑制率可分別達(dá)68.4％和59.6％。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示唑來膦酸是通過抑制黏附斑激酶的磷酸化而對血管平滑肌細(xì)胞黏附及遷移產(chǎn)生抑制作用。光學(xué)顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察結(jié)果表明，經(jīng)唑來膦酸處理后的部分血管平滑肌細(xì)胞收縮成球形，并見大量的溶酶體積聚于胞漿內(nèi)。
　　(2)4組大鼠受損頸動脈的內(nèi)膜面積平均值分別為0.271mm2、0.117mm2、0.278mm2和0.034mm2，中膜面積平均值

6、分別為0.139mm2、0.150mm2、0.152mm2和0.135mm2。因此，Ⅱ組及Ⅳ組內(nèi)膜/中膜面積比值較Ⅰ組和Ⅲ組分別下降59％和87％。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示4組大鼠受損頸動脈內(nèi)膜中增殖細(xì)胞核抗原陽性細(xì)胞的比值分別為38.73±5.54％，23.14±6.95％.40.89±3.52％和14.05±8.64％。透射電子顯微鏡觀察結(jié)果表明，Ⅱ組及Ⅳ組受損頸動脈的血管平滑肌細(xì)胞中有大量溶酶體積聚。
　　結(jié)論：(1)通過本研究