通心絡(luò)抑制血管內(nèi)膜增生的作用和機(jī)制研究.pdf

1、病理性血管重塑(vascular remodeling)是指血管壁結(jié)構(gòu)對(duì)血流變化、機(jī)械負(fù)荷或者血管損傷所發(fā)生的失代償性改變，進(jìn)而可導(dǎo)致許多血管疾病的發(fā)生和發(fā)展，比如動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄以及血管旁路移植失敗等。新生內(nèi)膜形成是血管重塑的主要病理特征之一，病理學(xué)基礎(chǔ)主要為局部炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和中膜平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。大量研究表明，炎癥應(yīng)答在引發(fā)和加劇血管重塑中起關(guān)鍵作用，表現(xiàn)為單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)以及炎性介質(zhì)的釋放，由此觸發(fā)血管平

2、滑肌細(xì)胞(vascular smoothmuscle cells，VSMCs)向內(nèi)膜下遷移和增殖，最終導(dǎo)致管腔狹窄甚至閉塞。
　　MicroRNAs(miRNAs)是體內(nèi)存在的一類非編碼小RNA，長(zhǎng)度通常不超過22個(gè)核苷酸，主要通過抑制翻譯或促進(jìn)mRNA降解在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。研究證實(shí)，許多miRNAs都參與了血管重塑過程。MicroRNA-155(miR-155)是一個(gè)炎癥相關(guān)miRNA，在巨噬細(xì)胞和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)

3、上調(diào)。miR-155通過靶向抑制巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答來發(fā)揮促炎或抗炎的作用。近期研究表明，miR-155在動(dòng)脈粥樣硬化中同樣具有抗斑塊形成和促斑塊形成的雙重作用，但其在血管重塑及新生內(nèi)膜形成中的作用還尚不清楚。
　　通心絡(luò)是一種中藥復(fù)方提取物，由人參、赤芍、酸棗仁、檀香、降香、土鱉蟲、蜈蚣、水蛭、蟬蛻、全蝎、乳香及冰片組成。該藥已顯示出多種血管保護(hù)樣作用，包括降血脂、抗氧化、抗血栓形成、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、促進(jìn)血管新生以及抑制炎癥反應(yīng)等

4、?？寡资峭ㄐ慕j(luò)發(fā)揮血管保護(hù)作用的主要機(jī)制之一，miRNA是否介導(dǎo)或參與通心絡(luò)抑制血管炎癥反應(yīng)的過程目前還尚不清楚。因此，本研究利用小鼠頸動(dòng)脈結(jié)扎模型誘導(dǎo)血管內(nèi)膜增生，探討通心絡(luò)是否通過調(diào)控miR-155的表達(dá)而發(fā)揮抑制血管炎癥及血管重塑的作用，旨在為闡明通心絡(luò)的血管保護(hù)分子機(jī)制以及擴(kuò)大臨床應(yīng)用范圍提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分通心絡(luò)抑制頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的內(nèi)膜增生和血管炎癥反應(yīng)
　　目的:觀察通心絡(luò)對(duì)頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的內(nèi)膜增生和局部

5、炎癥應(yīng)答中的抑制作用。
　　方法:1于左側(cè)頸總動(dòng)脈近分叉處結(jié)扎C57BL/6小鼠頸總動(dòng)脈誘導(dǎo)內(nèi)膜增生。2應(yīng)用蘇木精-伊紅染色和Image-Pro Plus Analyzer version5.1軟件觀察和評(píng)價(jià)內(nèi)膜增生的形態(tài)學(xué)改變。3 qRT-PCR檢測(cè)VEGF-α、FGF-b、TGF-β、PDGF-BB、TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平。4應(yīng)用mac-2和SMA免疫熒光雙重染色觀察巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和血管平滑肌細(xì)胞增殖

6、。5免疫組化法觀察TNF-α和IL-1β的表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1、通心絡(luò)抑制頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的內(nèi)膜增生
　　形態(tài)學(xué)分析顯示，頸動(dòng)脈結(jié)扎7天后既有新生內(nèi)膜形成，到結(jié)扎后14天內(nèi)膜增生進(jìn)一步加重，到結(jié)扎后21天，新生內(nèi)膜大量增加至血管壁厚度的70％以上。與結(jié)扎組相比，通心絡(luò)低劑量、中劑量和高劑量灌胃組（于術(shù)前3天開始，每天灌胃給藥一次）結(jié)扎血管的內(nèi)膜面積和I/M比值在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)（7、14和21天）均顯著減少。同時(shí)，通心

7、絡(luò)中劑量和高劑量灌胃組對(duì)內(nèi)膜增生的抑制作用比通心絡(luò)低劑量灌胃組更顯著。以上結(jié)果說明，通心絡(luò)呈劑量依賴性抑制頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的新生內(nèi)膜形成。
　　2、通心絡(luò)抑制頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的炎性因子的表達(dá)
　　qRT-PCR結(jié)果顯示，在頸動(dòng)脈結(jié)扎后21天，結(jié)扎血管中的TGF-β、PDGF-BB、TNF-α、IL-1β的mRNA水平均比對(duì)照組血管顯著升高。尤其是TNF-α的mRNA水平達(dá)對(duì)照組的17倍。與結(jié)扎組相比，通心絡(luò)中劑量灌胃組顯著降低了

8、PDGF-BB、TNF-α、IL-1β的mRNA水平，但沒有影響TGF-β的mRNA水平。這些結(jié)果說明，通心絡(luò)對(duì)頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的炎性因子的上調(diào)有顯著的抑制作用。
　　3、通心絡(luò)抑制頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和血管平滑肌細(xì)胞增殖，減少結(jié)扎血管中TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生
　　免疫熒光結(jié)果顯示，在頸動(dòng)脈結(jié)扎后21天的血管新生內(nèi)膜中有大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)伴有血管平滑肌細(xì)胞的大量增殖。然而，在通心絡(luò)中劑量灌胃組的結(jié)扎血管中，幾

9、乎觀察不到巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，中膜平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移也不明顯。免疫組化顯示，與對(duì)照組相比，損傷21天后結(jié)扎血管的新生內(nèi)膜中有大量TN-α、IL-1β的產(chǎn)生，而通心絡(luò)中劑量灌胃顯著抑制了結(jié)扎血管中TNF-α和IL-1β的表達(dá)。
　　4、結(jié)扎后再給予通心絡(luò)干預(yù)仍然可以顯著抑制頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的內(nèi)膜增生
　　形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，于頸動(dòng)脈結(jié)扎后3天再給予通心絡(luò)中劑量灌胃，與結(jié)扎組相比，在術(shù)后21天仍然抑制了血管內(nèi)膜增生，但抑制作用與術(shù)前預(yù)

10、干預(yù)組比較有所減弱。
　　小結(jié):
　　通心絡(luò)可以顯著抑制小鼠頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的內(nèi)膜增生，其作用與減少巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)從而減輕局部炎癥反應(yīng)有關(guān)。
　　第二部分通心絡(luò)通過下調(diào)miR-155的表達(dá)發(fā)揮抑制內(nèi)膜增生的作用
　　目的:觀測(cè)miR-155是否參與頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的新生內(nèi)膜形成過程，以及通心絡(luò)是否通過調(diào)節(jié)miR-155的表達(dá)來發(fā)揮抑制內(nèi)膜增生和血管炎癥反應(yīng)的作用。
　　方法:1對(duì)miR-155基因敲除(miR-1

11、55-/-)小鼠和野生型(WT)小鼠行左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)。蘇木精-伊紅染色和Image-Pro Plus Analyzerversion5.1軟件觀察和評(píng)價(jià)內(nèi)膜增生的形態(tài)學(xué)改變。2將腺病毒載體Ad-miR-155（空載體Ad-null作為對(duì)照）經(jīng)尾靜脈注射導(dǎo)入WT小鼠體內(nèi)過表達(dá)miR-155。3 qRT-PCR檢測(cè)miR-155、TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平。4 mac-2免疫組化染色觀察巨噬細(xì)胞浸潤(rùn);免疫組化染色觀察TNF-α的表

12、達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1、通心絡(luò)抑制頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的miR-155的表達(dá)
　　與未結(jié)扎的對(duì)照組相比，miR-155在頸動(dòng)脈結(jié)扎14天和21天后的小鼠血管中均顯著上調(diào)，通心絡(luò)中劑量灌胃在結(jié)扎后14天和21天均明顯抑制了結(jié)扎血管中miR-155的表達(dá)。在頸動(dòng)脈結(jié)扎7天后的結(jié)扎組和通心絡(luò)中劑量灌胃組的血管中miR-155的表達(dá)沒有明顯變化。
　　2、 miR-155缺失抑制頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的內(nèi)膜增生，而miR-155過

13、表達(dá)部分拮抗了通心絡(luò)對(duì)內(nèi)膜增生的抑制作用
　　形態(tài)學(xué)分析顯示，頸動(dòng)脈結(jié)扎21天后，WT小鼠血管中有大量新生內(nèi)膜形成，而miR-155-/-小鼠的結(jié)扎血管，無論是I/M比值還是內(nèi)膜面積均顯著低于WT小鼠，說明miR-155的缺失抑制了頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的內(nèi)膜增生。同時(shí)，在miR-155-/-小鼠給予通心絡(luò)中劑量灌胃后，其結(jié)扎血管中的內(nèi)膜增生進(jìn)一步減少。
　　給通心絡(luò)中劑量灌胃的WT小鼠尾靜脈注射Ad-miR-155（于術(shù)前1天開始

14、注射，每隔7天注射一次，共注射3次），與Ad-null注射組比較，在結(jié)扎21天后的血管中miR-155上調(diào)3.5倍。在通心絡(luò)中劑量灌胃的WT小鼠中，頸動(dòng)脈結(jié)扎21天后，與Ad-null注射組相比，Ad-miR-155注射組的結(jié)扎血管中I/M比值和內(nèi)膜面積均顯著增加，說明miR-155過表達(dá)部分拮抗了通心絡(luò)對(duì)內(nèi)膜增生的抑制作用。
　　3、 miR-155缺失抑制頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和炎性因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)，而m

15、iR-155過表達(dá)部分拮抗了通心絡(luò)對(duì)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和TNF-α表達(dá)的抑制作用
　　免疫組化結(jié)果顯示，頸動(dòng)脈結(jié)扎21天后，WT小鼠的結(jié)扎血管的新生內(nèi)膜中有大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，而miR-155-/-小鼠的結(jié)扎血管中巨噬細(xì)胞顯著減少。給予通心絡(luò)中劑量灌胃的miR-155-/-小鼠的結(jié)扎血管中幾乎觀察不到浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞。同時(shí)，在通心絡(luò)中劑量灌胃的WT小鼠中，與尾靜脈注射Ad-null組相比，尾靜脈注射Ad-miR-155組的結(jié)扎血管中浸潤(rùn)的巨

16、噬細(xì)胞明顯增多。
　　qRT-PCR結(jié)果顯示，在頸動(dòng)脈結(jié)扎后21天，miR-155-/-小鼠結(jié)扎血管中TNF-α的mRNA水平減少到WT小鼠的11％。給予通心絡(luò)中劑量灌胃的miR-155-/-小鼠的結(jié)扎血管中TNF-α的mRNA水平減少到給予通心絡(luò)灌胃的WT小鼠的20％。此外，在通心絡(luò)中劑量灌胃的WT小鼠中，與Ad-null注射組相比，Ad-miR-155注射組的結(jié)扎血管中TNF-α的mRNA水平升高了2.2倍。以上結(jié)果說明，mi

17、R-155介導(dǎo)了結(jié)扎血管中TNF-α的表達(dá)，而miR-155過表達(dá)拮抗了通心絡(luò)對(duì)TNF-α表達(dá)的抑制作用。免疫組化顯示，各組的TNF-α的表達(dá)水平與qRT-PCR結(jié)果一致。另外，與WT小鼠相比，miR-155-/-小鼠結(jié)扎血管中的IL-1β mRNA水平下降了50％，但給予通心絡(luò)中劑量灌胃的miR-155-/-小鼠與給予通心絡(luò)中劑量灌胃的WT小鼠組比較，IL-1β mRNA水平無明顯變化，同時(shí)，在通心絡(luò)中劑量灌胃的WT小鼠中，Ad-mi

18、R-155注射使miR-155過表達(dá)后并沒影響結(jié)扎血管中IL-1β的mRNA水平。這些結(jié)果說明，通心絡(luò)對(duì)IL-1β表達(dá)的抑制作用并不是通過調(diào)節(jié)miR-155的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
　　4、在頸動(dòng)脈結(jié)扎后期過表達(dá)miR-155仍可部分拮抗通心絡(luò)對(duì)內(nèi)膜增生的抑制作用
　　在通心絡(luò)中劑量灌胃的WT小鼠中，于頸動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后第14天注射Ad-miR-155，與Ad-null注射組相比，Ad-miR-155注射組結(jié)扎血管的內(nèi)膜增生加重，說明在血

19、管重塑后期過表達(dá)miR-155仍可減弱通心絡(luò)對(duì)內(nèi)膜增生的抑制作用。
　　小結(jié):
　　miR-155參與頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的新生內(nèi)膜的形成過程;通心絡(luò)對(duì)頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的內(nèi)膜增生和血管炎癥應(yīng)答的抑制作用在一定程度上是通過抑制miR-155的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
　　第三部分通心絡(luò)通過阻斷miR-155與TNF-α之間的反饋環(huán)路抑制巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答
　　目的:揭示通心絡(luò)調(diào)節(jié)miR-155表達(dá)以及抑制巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答的分子機(jī)制。

20、r>　　方法:1用不同因素處理原代培養(yǎng)的小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞(BMMs)。2腺病毒感染實(shí)驗(yàn)用于在BMMs中過表達(dá)miR-155。3 Westernblot檢測(cè)p-Akt和Akt1的表達(dá)。4 siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)用于在BMMs中敲低Akt1。5 qRT-PCR檢測(cè)miR-155、TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平。6 ELISA檢測(cè)BMMs培養(yǎng)基中TNF-α和IL-1β的含量。7傷口愈合實(shí)驗(yàn)。8細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　1、

21、通心絡(luò)通過阻斷TNF-α和miR-155之間形成的正反饋環(huán)路而抑制巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答
　　qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TNF-α刺激使miR-155的表達(dá)水平上升2.5倍，通心絡(luò)預(yù)孵育以劑量依賴性的方式抑制TNF-α誘導(dǎo)的miR-155表達(dá)上調(diào)。另一方面，在對(duì)照組、IL-1β刺激組和通心絡(luò)預(yù)孵育+IL-1β刺激組之間miR-155的表達(dá)水平無明顯差異。這些結(jié)果說明，TNF-α可以促進(jìn)BMMs中miR-155的表達(dá)，但I(xiàn)L-

22、1β對(duì)miR-155的表達(dá)無影響。與Ad-null感染組相比，Ad-miR-155感染的BMMs中TNF-α的mRNA水平升高6倍。來源于miR-155-/-小鼠的BMMs中TNF-α的mRNA水平比WT組顯著降低。與qRT-PCR結(jié)果相一致，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，BMMs中過表達(dá)miR-155顯著增加培養(yǎng)基中TNF-α的含量，而miR-155-/-小鼠的BMMs培養(yǎng)基中TNF-α含量比WT組明顯下降。另一方面，miR-155過表達(dá)或

23、敲除均未影響B(tài)MMs及其培養(yǎng)基中IL-1β的表達(dá)水平。以上結(jié)果顯示，TNF-α和miR-155之間形成正反饋環(huán)路促進(jìn)巨噬細(xì)胞的炎癥應(yīng)答。
　　qRT-PCR和ELISA結(jié)果顯示，與單純過表達(dá)miR-155組比較，通心絡(luò)預(yù)孵育減少了過表達(dá)miR-155誘導(dǎo)的TNF-α的表達(dá)上調(diào)，TNF-α的mRNA水平和培養(yǎng)基中的蛋白水平分別減少到過表達(dá)miR-155組的31％和78％。同時(shí)，miR-155-/-BMMs無論給予或不給予通心絡(luò)預(yù)孵育

24、，其TNF-α的表達(dá)均處于較低水平。這些結(jié)果表明，通心絡(luò)可以阻斷TNF-α和miR-155之間形成的正反饋環(huán)路，這可能是其抑制炎癥應(yīng)答發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制之一。
　　2、通心絡(luò)通過上調(diào)Akt1抑制巨噬細(xì)胞中miR-155的表達(dá)
　　Western blot結(jié)果顯示，BMMs被TNF-α刺激10、20和40分鐘后p-Akt均輕微下調(diào)，通心絡(luò)預(yù)孵育(2 h)+TNF-α刺激組的p-Akt在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)(10、20和40分鐘)均顯著上

25、調(diào)。但是，通心絡(luò)預(yù)孵育(2 h)+TNF-α刺激組的總Akt1的蛋白水平在這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)也顯著上調(diào)。這些結(jié)果說明，通心絡(luò)預(yù)孵育后p-Akt水平上升是由于上調(diào)了總的Akt1蛋白表達(dá)引起的。
　　qRT-PCR結(jié)果顯示，在BMMs中敲低Akt1后，通心絡(luò)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的miR-155表達(dá)上調(diào)的抑制被消除，說明通心絡(luò)抑制BMMs中miR-155的表達(dá)是通過上調(diào)Akt1實(shí)現(xiàn)的。
　　3、miR-155缺失抑制巨噬細(xì)胞的遷移，但不影響

26、巨噬細(xì)胞的粘附
　　傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，來源于miR-155-/-小鼠的BMMs在劃痕后遷移的距離比WT小鼠的BMMs有所下降，說明miR-155缺失在一定程度上抑制了巨噬細(xì)胞的遷移。
　　細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)顯示，與WT組相比，miR-155-/-BMMs與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附數(shù)量沒有明顯變化，說明miR-155缺失不影響巨噬細(xì)胞的粘附。
　　小結(jié):
　　通心絡(luò)通過阻斷TNF-α和miR-155之間形成的正反饋環(huán)路而抑制巨

27、噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答;Akt1介導(dǎo)通心絡(luò)對(duì)巨噬細(xì)胞中miR-155表達(dá)的抑制作用;miR-155缺失抑制巨噬細(xì)胞的遷移，但不影響巨噬細(xì)胞的粘附。
　　結(jié)論:
　　1、通心絡(luò)抑制頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的內(nèi)膜增生。
　　2、通心絡(luò)通過抑制炎性因子的表達(dá)和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)而減輕血管炎癥反應(yīng)。
　　3、 miR-155缺失抑制頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的內(nèi)膜增生;通心絡(luò)對(duì)內(nèi)膜增生的抑制作用是通過抑制miR-155的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
　　4、 TN