通心絡改善缺氧性腦損傷的作用機制.pdf

1、目的:通心絡對缺血缺氧性腦損傷具有保護作用，但其作用機制目前尚不清楚。本研究在動物模型和細胞水平上研究通心絡對腦組織微血管缺氧性損傷的保護作用及其作用機制，為通心絡用于防治缺血性腦損傷提供理論依據。
　　方法:選取雄性C57BL/6J小鼠，利用低壓氧艙制備缺氧性腦損傷動物模型，給予通心絡灌胃處理后，冰凍切片觀察腦組織微血管內皮緊密連接蛋白表達，CD31免疫熒光染色對微血管內皮細胞進行染色定位;在細胞水平上，將體外培養(yǎng)的微血管內皮細

2、胞與通心絡預孵育，利用密封缺氧罐使細胞缺氧，取細胞爬片進行緊密連接蛋白免疫熒光染色。利用Westernblot分析檢測緊密連接蛋白的表達變化。利用脂質體將不同磷酸化位點突變的KLF4質粒轉入細胞內，檢測對緊密連接蛋白表達的影響。
　　結果:
　　1通心絡通過增加血管內皮緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的表達改善缺氧性腦損傷。
　　CD31與VE-cadherin、β-catenin、ZO

3、-1的免疫熒光雙染色結果顯示，與正常對照組相比，通心絡處理組的微血管緊密連接蛋白完整性好，內皮染色更連續(xù)、線條更平滑。表明通心絡處理后腦組織微血管內皮的緊密連接蛋白表達增加，血管內皮完整性較好。缺氧組小鼠腦組織的微血管緊密連接蛋白表達顯著降低，導致微血管緊密連接出現殘缺，表明缺氧導致了微血管損傷;缺氧動物給予通心絡處理后，逆轉了小鼠腦組織微血管的緊密連接蛋白表達，內皮細胞緊密排布，血管內皮完整性增強。以上結果顯示，通心絡可以促進小鼠腦組

4、織微血管緊密連接蛋白的表達。
　　Westem blot分析結果顯示，與未經通心絡處理的小鼠相比，通心絡處理組緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin的表達均有所增高，同時KLF4的表達也明顯上調。以上結果表明，通心絡通過增加內皮細胞緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin和ZO-1的表達，進而緩解缺氧對小鼠腦組織的損傷。
　　2在缺氧條件下，通心絡能促進體外培養(yǎng)的微血管內皮細胞表達VE-cadh

5、erin、β-catenin和ZO-1。
　　體外培養(yǎng)微血管內皮細胞，取細胞爬片對緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin和ZO-1進行免疫熒光染色。與對照組相比，通心絡處理組的內皮細胞周圍的染色亮度較強，表明通心絡可以促進微血管內皮細胞緊密連接蛋白的表達。細胞經缺氧處理后，緊密連接蛋白表達明顯降低;通心絡預孵育可逆轉缺氧對緊密連接蛋白表達的抑制作用。
　　Western blot分析結果顯示，與未經通心絡處理

6、的細胞相比，通心絡處理組細胞的緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin、 ZO-1表達均增高，KLF4的表達水平也明顯升高。
　　3通心絡通過促進KLF4磷酸化上調緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的表達。
　　為了確定通心絡誘導緊密連接蛋白表達與KLF4磷酸化修飾之間的關系，利用免疫共沉淀檢測通心絡對KLF4磷酸化修飾的影響。結果顯示，與對照組相比，通心絡處理組的KLF4磷酸化水

7、平增高，變化趨勢與緊密連接蛋白變化相一致。表明通心絡是通過促進KLF4磷酸化來促進VE-cadherin、β-catenin、ZO-1表達的。
　　4通心絡通過促進KLF4分子中S444和S415的磷酸化上調緊密連接蛋白的表達。
　　用不同的KLF4絲氨酸位點突變質粒轉染微血管內皮細胞，觀察其對緊密連接蛋白表達的影響，結果顯示，在轉染野生型GFP-KLF4和GFP-S444A、GFP-S415A點突變質粒組，血管內皮緊密連接

8、蛋白VE-cadherin、β-catenin、 ZO-1的表達均低于轉染GFP-N1空載體組;而轉染GFP-S470A點突變質粒組，細胞內三種緊密連接蛋白的表達與GFP-N1組相比無明顯差異。
　　內皮細胞與通心絡預孵育24 h，再用KLF4絲氨酸位點突變體質粒轉染細胞后給預缺氧刺激12h。Western blot分析結果顯示，與對照組相比，通心絡孵育的內皮細胞中KLF4表達顯著提高，緊密連接蛋白表達也同時上調;與野生型GFP-

9、KLF4相比，在轉染GFP-S470A的細胞中緊密連接蛋白表達沒有明顯變化;在轉染GFP-S444A、GFP-S415A的細胞中，緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的表達顯著下降。
　　5通心絡通過激活AKT信號途徑促進KLF4磷酸化。
　　對從腦組織和微血管內皮細胞中提取的蛋白質進行Western blot分析，結果顯示，通心絡處理可使AKT磷酸化水平明顯增加。
　　體外培養(yǎng)的微血管內皮

10、細胞與AKT抑制劑共孵育后，再檢測KLF4磷酸化修飾狀態(tài)，結果顯示，與單純通心絡處理組相比，給予AKT抑制劑后再用通心絡處理的細胞，KLF4的磷酸化水平降低。
　　結論:
　　1通心絡對缺氧性腦損傷具有保護作用;
　　2通心絡增加微血管內皮細胞緊密連接蛋白的表達;
　　3通心絡通過促進KLF4磷酸化上調緊密連接蛋白的表達;
　　4通心絡促進KLF4分子中S444和S415位點的磷酸化;
　　5通心絡通