HBO對新生鼠缺血缺氧性腦損傷的治療效應(yīng)及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的: 1、判斷高壓氧(HBO)是否對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠具有治療作用； 2、觀察HBO對于缺氧缺血性腦損傷新生大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的影響； 3、探討HBO治療的具體作用機(jī)制，為探索治療新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)的有效方法提供科學(xué)的實驗依據(jù)和新的思路。 方法: 將新生7日齡SD大鼠120只隨機(jī)分成3組，分別為假手術(shù)組(sham)(n=40)、缺氧缺血性模型組(control)(n=40)、

2、HBO治療組(trial)(n=40)。采用經(jīng)典的Rice法制成HIBD模型，SD大鼠經(jīng)乙醚麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺上，頸部常規(guī)消毒，做頸部正中切口游離左側(cè)頸總動脈并雙線結(jié)扎，剪斷線結(jié)之間的血管，縫合皮下及皮膚?？p合皮膚后，立即置于8％氧濃度、艙溫(36±1℃)的自制常壓缺氧艙中，持續(xù)2小時后出艙。造模過程中密切觀察SD大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的異常改變并進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評分，將神經(jīng)功能缺陷評分為1-3分者納入實驗。sham組切開皮膚后，僅分離右側(cè)頸

3、總動脈，不結(jié)扎也不進(jìn)行缺氧及注射藥物等處理：control組在造膜成功后，不再做其他處理；trial組在造模成功后即給予高壓氧治療(勻速升壓10min，使艙內(nèi)壓力達(dá)0.2Mpa后排氣，保持艙內(nèi)壓力及氧濃度恒定，穩(wěn)壓20min后關(guān)閉進(jìn)氣閥，勻速降壓10min至常壓出艙，最長治療時間5天，每天1次，最多治療5天)。于缺血缺氧后7天、14天和21天各處死10只，灌注固定后，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，將固定的鼠腦從前囟后以視交叉為中心，前后2～6

4、mm行冠狀面冰凍切片。選取10～20μm的冰凍切片切片進(jìn)行HE染色，60μm的冰凍切片進(jìn)行免疫組化染色；分別觀察腦組織病理改變，以及腦海馬區(qū)和腦感覺運動皮層區(qū)nestin蛋白的陽性表達(dá)情況。剩余的30只大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)，以大鼠37～41日齡的學(xué)習(xí)記憶功能(morris水迷宮實驗)、大鼠42日齡的腦組織形態(tài)學(xué)改變和大鼠42日齡神經(jīng)元的機(jī)能狀態(tài)(nissl實驗)來判斷干預(yù)效果。 結(jié)果: 1、HE染色：sham組海馬各部組織結(jié)構(gòu)正

5、常，可見有3-4層椎體細(xì)胞，排列整齊緊密，高倍鏡下可見這些神經(jīng)元核大而園，透明，有1-2個明顯的核仁。control組術(shù)后7天可見椎體細(xì)胞溶解，突起斷裂、變短或消失，輪廓模糊，椎體細(xì)胞減少，海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞排列散亂，周圍膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯；術(shù)后14天及21天相似，表現(xiàn)為椎體細(xì)胞排列紊亂、疏松，層次不清，細(xì)胞間隙增大，神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞嚴(yán)重皺縮、深染，核縮小呈梭形及三角形，核仁不清，僅殘留部分正常神經(jīng)元。trial組術(shù)后7天可見大量的椎體

6、細(xì)胞溶解，突起斷裂，變短或消失，輪廓模糊，椎體細(xì)胞減少，海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞排列散亂；術(shù)后14天及21天相似，表現(xiàn)為椎體細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞胞漿豐富，核仁清楚，但椎體細(xì)胞層較假手術(shù)組左側(cè)薄。 2、nestin蛋白免疫組化染色陽性表達(dá)在腦不同部位的檢測：兩個不同部位的計數(shù)均以缺氧缺血后第7天trial組的nestin陽性細(xì)胞數(shù)目最高，14天后nestin表達(dá)開始下降，21天仍有表達(dá)。各組的陽性細(xì)胞數(shù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各實驗組均數(shù)

7、間的比較采用析因設(shè)計資料方差分析，α=0.05為顯著性檢驗標(biāo)準(zhǔn)。 3組大鼠不同處死時間點大鼠腦海馬區(qū)Nestin陽性細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察：sham組：nestin陽性表達(dá)的神經(jīng)前體細(xì)胞染色偏淡，胞體突起不明顯。control組和trial組：陽性表達(dá)的神經(jīng)前體細(xì)胞呈明顯的區(qū)域性分布，胞漿呈棕黃色，染色較深，胞體突起明顯，胞核呈空泡狀。主要分布在海馬區(qū)的分子層、椎體細(xì)胞層和內(nèi)顆粒細(xì)胞層。不同時間點nestin陽性細(xì)胞在分布區(qū)域、形態(tài)以

8、及生長方式等方面存在一定的差異。 3組大鼠不同處死時間點左側(cè)大腦海馬區(qū)Nestin陽性細(xì)胞檢出率比較：使用析因設(shè)計資料的方差分析，結(jié)果顯示組間差異有顯著性(F=342.677，P<0.001)，各實驗組每一時間點的nestin陽性細(xì)胞數(shù)目從多到少分別為trial組>control組>sham組。不同時間點間差異也有顯著性(F=185.654，P<0.001)，隨著時間的延長，nestin陽性細(xì)胞數(shù)大體呈下降趨勢。實驗組與時間之間

9、存在交互作用(F=72.167，P<0.001)，提示各實驗組nestin陽性細(xì)胞檢出率的變化隨時間的增加而具有不同的變化趨勢。進(jìn)一步分析單獨效應(yīng)，結(jié)果顯示各時間點內(nèi)兩組間比較均有顯著性差異(P<0.001)，各實驗組每一時間點的nestin陽性細(xì)胞數(shù)目均為trial組最多，sham組最少。每個實驗組的nestin陽性細(xì)胞數(shù)目在不同時間點間的比較顯示，除sham組P=0.006外，其余各組P值均小于0.001。同一組內(nèi)nestin陽性細(xì)

10、胞數(shù)目在不同時間點的比較均為7天最多，21天最少。 3組大鼠不同處死時間點大鼠腦感覺運動皮質(zhì)區(qū)nestin陽性細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察：nestin陽性細(xì)胞呈大小不等的圓形，可見0-1個突起，胞漿呈棕黃色，胞核呈空泡狀。sham組腦感覺運動皮質(zhì)區(qū)可見少量散在分布的nestin陽性表達(dá)的神經(jīng)前體細(xì)胞，control組和sham組可見nestin陽性表達(dá)的神經(jīng)前體細(xì)胞在感覺運動皮質(zhì)區(qū)呈明顯的區(qū)域性分布，主要位于椎體細(xì)胞層和顆粒細(xì)胞層。不同時

11、間點Nestin陽性細(xì)胞在分布區(qū)域、形態(tài)以及生長方式等方面存在一定的差異。 3組大鼠不同處死時間點左側(cè)大腦海馬區(qū)Nestin陽性細(xì)胞檢出率比較：使用析因設(shè)計資料的方差分析，結(jié)果顯示組間差異有顯著性(F=25.99，P<0.001)，各實驗組每一時間點的nestin陽性細(xì)胞數(shù)目從多到少分別為trial組>control組>sham組。不同時間點間差異也有顯著性(F=10.832，P<0.001)，隨著時間的延長，nestin陽性細(xì)

12、胞數(shù)大體呈下降趨勢。實驗組與時間之間不存在交互作用(F=0.509，P=0.729)，提示各實驗組nestin陽性細(xì)胞檢出率的變化趨勢不隨時間的變化而改變。 3、遠(yuǎn)期行為學(xué)影響：control組大鼠的學(xué)習(xí)記功能嚴(yán)重不良伴海馬結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，與sham組相比，水迷宮實驗中平均逃逸潛伏期延長(54.51s與22.34s，P<0.001)、搜索時間和搜索路程縮短(分別為31.15s與54.51s，5.53m與9.88m，均P<0.001

13、)；HBO治療明顯減輕缺氧缺血性腦損傷(HIBD)大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能障礙(潛伏期：38.78s與54.51s；搜索時間：36.38s與31.15s；搜索路程：6.88m與5.53m，P<0.001)。 4、腦萎縮程度：control組缺氧缺血側(cè)(左)大腦的重量較右側(cè)輕，萎縮了(20.2±11.4)％；而HBO治療能夠減輕缺氧缺血側(cè)大腦的萎縮程度，治療后左側(cè)大腦萎縮百分比為(8.5±8.3)％，低于control組(P=0.001

14、)。且HBO治療后大腦萎縮程度與sham組(3.5±5.7)％相比無顯著性差異(P=0.560)。 5、nissl染色：正常對照組椎體細(xì)胞排列整齊緊密，呈橢圓形，核仁清楚居中，細(xì)胞質(zhì)中尼氏體清晰可見，均勻一致。Control組細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙增寬；細(xì)胞質(zhì)中尼氏體減少或消失，大量神經(jīng)元表現(xiàn)出胞體顯著縮小、著色加深等損傷特征，同時，神經(jīng)元丟失現(xiàn)象也較為明顯；與sham組比較，CA1區(qū)椎體細(xì)胞密度明顯下降。trial組細(xì)胞排列整

15、齊，CA1區(qū)椎體細(xì)胞密度明顯增加；存活神經(jīng)元數(shù)目較control組明顯增多(P<0.001)，而與sham組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P=1.0)。 結(jié)論： 1、HBO早期干預(yù)能夠減輕HIBD所致的海馬CA1區(qū)組織學(xué)損傷，改善由HIBD引起的學(xué)習(xí)記憶能力下降； 2、HBO早期干預(yù)可增加海馬區(qū)和感覺運動皮質(zhì)區(qū)nestin陽性細(xì)胞的數(shù)目； 3、內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞參與了新生鼠缺氧缺血性損傷后神經(jīng)系統(tǒng)功能的重建過程；而HB