TAP-SSL5抑制血管內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生的作用和機制及其成藥性初步評價.pdf

1、研究背景：
　　血管再狹窄及血栓形成是導致血管球囊成形術(shù)或支架植入術(shù)后不良事件的主要原因。炎癥反應在血管損傷后新生內(nèi)膜形成過程中具有重要作用。粒細胞以及血小板被激活后可釋放大量的炎癥介質(zhì),是導致血管壁炎癥反應的重要原因。血小板、內(nèi)皮細胞和粒細胞激活后可釋放大量的P-/E-/L-選擇素,它們通過與其配體P-選擇素糖蛋白配體-1(p-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)結(jié)合,進一步激活粒細胞和血

2、小板,從而同時促進炎癥反應和血栓形成。SSL5為金黃色葡萄球菌的分泌型蛋白,可與粒細胞表面的PSGL-1結(jié)合,從而抑制粒細胞在內(nèi)皮細胞表面的黏附,并可抑制細胞因子對粒細胞的激活作用,同時能夠抑制內(nèi)皮祖細胞與P-選擇素的結(jié)合。我們在前期工作中已將其與凝血因子Xa(coagulant factor Xa,FXa)的強效抑制劑-蜱抗凝血肽(tick anticoagulant peptide,TAP)通過基因重組技術(shù)相融合,成功構(gòu)建出新型重組

3、融合蛋白TAP-SSL5,其保留了TAP和SSL5的功能,從而具有抗炎、抗凝雙重活性;TAP-SSL5可與PSGL-1有效結(jié)合,并可明顯抑制血漿FXa的活性。本課題在前期研究的基礎上,通過建立C57BL/6J小鼠頸動脈內(nèi)皮損傷模型,進一步研究融合蛋白TAP-SSL5對血管內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生的影響和機制,旨在較全面地評價融合蛋白TAP-SSL5的功能。同時,還研究了TAP-SSL5在兔體內(nèi)的藥代動力學、小鼠體內(nèi)的組織分布;并采用小鼠和大鼠

4、研究TAP-SSL5的一般藥理學作用,以及急性毒性和長期毒性,以對其成藥性進行初步評價。
　　研究方法：
　　1.融合蛋白TAP-SSL5和重組SSL5蛋白的表達與純化:按本課題組前期已建立的方法,進行TAP-SSL5和SSL5蛋白的純化。
　　2.融合蛋白TAP-SSL5對小鼠頸動脈內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生的影響和機制:以金屬纏繞型導絲損傷的方法,成功建立C57BL/6J小鼠頸動脈內(nèi)皮損傷模型,隨機分為5組,每組6只,分別

5、為PBS(對照組)、3mg/kgTAP-SSL5組、10mg/kgTAP-SSL5組、13mg/kgSSL5組及假手術(shù)組,腹腔注射給藥共14天。HE染色檢測血管損傷部位新生內(nèi)膜的形成情況,采用ImageProPlus6.0軟件檢測新生內(nèi)膜和中膜面積、計算內(nèi)膜/中膜比值;并進一步采用免疫組化染色檢測損傷部位血管壁中CD68+細胞(單核-巨噬細胞)、MMP-9和TNF-α的表達。
　　3.融合蛋白TAP-SSL5的藥代動力學研究:采用

6、固相氧化法(Iodogen法)將Na125I直接標記于TAP-SSL5,由耳緣靜脈給每只大耳兔注射18.5MBq的125I-TAP-SSL5,分別于注射后1.5、3、5、10、30、60、120、240、480min采血,稱重并測定放射性計數(shù),換算為血液放射性濃度,經(jīng)DAS軟件分析得出最佳房室模型及相關(guān)藥代動力學參數(shù);分別測定經(jīng)尾靜脈注射1.85MBq標記物后的昆明小鼠各器官質(zhì)量和放射性計數(shù),經(jīng)參考源校正后計算各臟器每克組織百分注射劑量

7、率(％ID/g),研究融合蛋白TAP-SSL5在小鼠體內(nèi)的組織分布。
　　4.融合蛋白TAP-SSL5的一般藥理學及安全性研究:采用昆明小鼠,經(jīng)尾靜脈一次注射TAP-SSL5,劑量分別為1mg/kg、3mg/kg和9mg/kg,研究其對小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的影響;采用SD大鼠,經(jīng)尾靜脈注射TAP-SSL5,劑量分別為1mg/kg和3mg/kg,研究其對大鼠主要生理指標的影響;采用昆明小鼠,尾靜脈一次性最大注射給藥TAP-SSL5(40mg

8、/kg),給藥體積0.5ml/10g,連續(xù)觀察14天,研究融合蛋白TAP-SSL5對小鼠的急性毒性;采用SD大鼠,腹腔注射給予1mg/kgTAP-SSL5連續(xù)8周,停藥恢復1周,隔天給藥,研究融合蛋白TAP-SSL5對大鼠的長期毒性。
　　結(jié)果：
　　1.10mg/kgTAP-SSL5可顯著抑制小鼠頸動脈損傷后的新生內(nèi)膜形成,與對照組相比,可使新生內(nèi)膜面積減少51.6%(p<0.001),使內(nèi)膜/中膜比值(intima-me

9、diaratio)減少37.5%(p<0.001);10mg/kgTAP-SSL5可有效抑制損傷部位血管壁中TNF-α及MMP-9的表達,與對照組相比,分別抑制了54.1%和33.2%(p<0.001);10mg/kgTAP-SSL5還可有效抑制血液中CD68+細胞(單核-巨噬細胞)向內(nèi)膜層的遷移和浸潤。
　　2.紙層析法測得125I-TAP-SSL5的標記率為(67.32±9.91)%,放射化學純度為(91.62±3.22)%,

10、比活度為(30.2±4.4)TBq/μmol;TAP-SSL5在大耳兔體內(nèi)的藥代動力學過程符合權(quán)重系數(shù)為1的二室模型,分布相半衰期(t1/2α)及消除相半衰期(t1/2β)分別為(0.08±0.04)h和(4.97±0.75)h,清除率(Clearance,Cl)為(0.015±0.011)ml/h,一室向二室轉(zhuǎn)運常數(shù)(K12)為(6.651±3.642)/h,二室向一室轉(zhuǎn)運常數(shù)(K21)為(4.072±1.737)/h。標記物在健康小

11、鼠體內(nèi)清除迅速,肺臟、肝臟及腎臟分布較多,但肝臟30min后分布即迅速下降。
　　3.TAP-SSL5對昆明小鼠一般行為情況、協(xié)調(diào)機能和戊巴比妥鈉閾下劑量催眠的協(xié)同作用無明顯影響;對SD大鼠的血壓、心率和呼吸頻率無明顯影響,與對照組比較均無明顯差異(p>0.05);尾靜脈一次最大注射40mg/kgTAP-SSL5,小鼠一般行為情況、血常規(guī)及主要臟器形態(tài)均正常,無死亡現(xiàn)象;SD大鼠,給予TAP-SSL5(1mg/kg,i.p)8周,

12、停藥恢復1周后,體重、血常規(guī)、臟器系數(shù)、血液生化及主要臟器形態(tài)與對照組比較均無明顯差異(p>0.05)。
　　結(jié)論：
　　融合蛋白TAP-SSL5可有效抑制C57BL/6J小鼠頸動脈內(nèi)皮損傷后新生內(nèi)膜形成;其機制可能與TAP-SSL5抑制血液中單核-巨噬細胞向內(nèi)膜層的遷移和浸潤,以及減少TNF-α和MMP-9等炎癥因子的表達有關(guān);125I-TAP-SSL5在健康大耳兔體內(nèi)的藥代動力學過程符合權(quán)重系數(shù)為1的二室模型,自體清除率