TAP-SSL5抑制血管內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生的作用和機(jī)制及其成藥性初步評(píng)價(jià).pdf

1、研究背景：
　　血管再狹窄及血栓形成是導(dǎo)致血管球囊成形術(shù)或支架植入術(shù)后不良事件的主要原因。炎癥反應(yīng)在血管損傷后新生內(nèi)膜形成過(guò)程中具有重要作用。粒細(xì)胞以及血小板被激活后可釋放大量的炎癥介質(zhì),是導(dǎo)致血管壁炎癥反應(yīng)的重要原因。血小板、內(nèi)皮細(xì)胞和粒細(xì)胞激活后可釋放大量的P-/E-/L-選擇素,它們通過(guò)與其配體P-選擇素糖蛋白配體-1(p-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)結(jié)合,進(jìn)一步激活粒細(xì)胞和血

2、小板,從而同時(shí)促進(jìn)炎癥反應(yīng)和血栓形成。SSL5為金黃色葡萄球菌的分泌型蛋白,可與粒細(xì)胞表面的PSGL-1結(jié)合,從而抑制粒細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附,并可抑制細(xì)胞因子對(duì)粒細(xì)胞的激活作用,同時(shí)能夠抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞與P-選擇素的結(jié)合。我們?cè)谇捌诠ぷ髦幸褜⑵渑c凝血因子X(jué)a(coagulant factor Xa,FXa)的強(qiáng)效抑制劑-蜱抗凝血肽(tick anticoagulant peptide,TAP)通過(guò)基因重組技術(shù)相融合,成功構(gòu)建出新型重組

3、融合蛋白TAP-SSL5,其保留了TAP和SSL5的功能,從而具有抗炎、抗凝雙重活性;TAP-SSL5可與PSGL-1有效結(jié)合,并可明顯抑制血漿FXa的活性。本課題在前期研究的基礎(chǔ)上,通過(guò)建立C57BL/6J小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷模型,進(jìn)一步研究融合蛋白TAP-SSL5對(duì)血管內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生的影響和機(jī)制,旨在較全面地評(píng)價(jià)融合蛋白TAP-SSL5的功能。同時(shí),還研究了TAP-SSL5在兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)、小鼠體內(nèi)的組織分布;并采用小鼠和大鼠

4、研究TAP-SSL5的一般藥理學(xué)作用,以及急性毒性和長(zhǎng)期毒性,以對(duì)其成藥性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。
　　研究方法：
　　1.融合蛋白TAP-SSL5和重組SSL5蛋白的表達(dá)與純化:按本課題組前期已建立的方法,進(jìn)行TAP-SSL5和SSL5蛋白的純化。
　　2.融合蛋白TAP-SSL5對(duì)小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生的影響和機(jī)制:以金屬纏繞型導(dǎo)絲損傷的方法,成功建立C57BL/6J小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷模型,隨機(jī)分為5組,每組6只,分別

5、為PBS(對(duì)照組)、3mg/kgTAP-SSL5組、10mg/kgTAP-SSL5組、13mg/kgSSL5組及假手術(shù)組,腹腔注射給藥共14天。HE染色檢測(cè)血管損傷部位新生內(nèi)膜的形成情況,采用ImageProPlus6.0軟件檢測(cè)新生內(nèi)膜和中膜面積、計(jì)算內(nèi)膜/中膜比值;并進(jìn)一步采用免疫組化染色檢測(cè)損傷部位血管壁中CD68+細(xì)胞(單核-巨噬細(xì)胞)、MMP-9和TNF-α的表達(dá)。
　　3.融合蛋白TAP-SSL5的藥代動(dòng)力學(xué)研究:采用

6、固相氧化法(Iodogen法)將Na125I直接標(biāo)記于TAP-SSL5,由耳緣靜脈給每只大耳兔注射18.5MBq的125I-TAP-SSL5,分別于注射后1.5、3、5、10、30、60、120、240、480min采血,稱(chēng)重并測(cè)定放射性計(jì)數(shù),換算為血液放射性濃度,經(jīng)DAS軟件分析得出最佳房室模型及相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù);分別測(cè)定經(jīng)尾靜脈注射1.85MBq標(biāo)記物后的昆明小鼠各器官質(zhì)量和放射性計(jì)數(shù),經(jīng)參考源校正后計(jì)算各臟器每克組織百分注射劑量

7、率(％ID/g),研究融合蛋白TAP-SSL5在小鼠體內(nèi)的組織分布。
　　4.融合蛋白TAP-SSL5的一般藥理學(xué)及安全性研究:采用昆明小鼠,經(jīng)尾靜脈一次注射TAP-SSL5,劑量分別為1mg/kg、3mg/kg和9mg/kg,研究其對(duì)小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的影響;采用SD大鼠,經(jīng)尾靜脈注射TAP-SSL5,劑量分別為1mg/kg和3mg/kg,研究其對(duì)大鼠主要生理指標(biāo)的影響;采用昆明小鼠,尾靜脈一次性最大注射給藥TAP-SSL5(40mg

8、/kg),給藥體積0.5ml/10g,連續(xù)觀察14天,研究融合蛋白TAP-SSL5對(duì)小鼠的急性毒性;采用SD大鼠,腹腔注射給予1mg/kgTAP-SSL5連續(xù)8周,停藥恢復(fù)1周,隔天給藥,研究融合蛋白TAP-SSL5對(duì)大鼠的長(zhǎng)期毒性。
　　結(jié)果：
　　1.10mg/kgTAP-SSL5可顯著抑制小鼠頸動(dòng)脈損傷后的新生內(nèi)膜形成,與對(duì)照組相比,可使新生內(nèi)膜面積減少51.6%(p<0.001),使內(nèi)膜/中膜比值(intima-me

9、diaratio)減少37.5%(p<0.001);10mg/kgTAP-SSL5可有效抑制損傷部位血管壁中TNF-α及MMP-9的表達(dá),與對(duì)照組相比,分別抑制了54.1%和33.2%(p<0.001);10mg/kgTAP-SSL5還可有效抑制血液中CD68+細(xì)胞(單核-巨噬細(xì)胞)向內(nèi)膜層的遷移和浸潤(rùn)。
　　2.紙層析法測(cè)得125I-TAP-SSL5的標(biāo)記率為(67.32±9.91)%,放射化學(xué)純度為(91.62±3.22)%,

10、比活度為(30.2±4.4)TBq/μmol;TAP-SSL5在大耳兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程符合權(quán)重系數(shù)為1的二室模型,分布相半衰期(t1/2α)及消除相半衰期(t1/2β)分別為(0.08±0.04)h和(4.97±0.75)h,清除率(Clearance,Cl)為(0.015±0.011)ml/h,一室向二室轉(zhuǎn)運(yùn)常數(shù)(K12)為(6.651±3.642)/h,二室向一室轉(zhuǎn)運(yùn)常數(shù)(K21)為(4.072±1.737)/h。標(biāo)記物在健康小

11、鼠體內(nèi)清除迅速,肺臟、肝臟及腎臟分布較多,但肝臟30min后分布即迅速下降。
　　3.TAP-SSL5對(duì)昆明小鼠一般行為情況、協(xié)調(diào)機(jī)能和戊巴比妥鈉閾下劑量催眠的協(xié)同作用無(wú)明顯影響;對(duì)SD大鼠的血壓、心率和呼吸頻率無(wú)明顯影響,與對(duì)照組比較均無(wú)明顯差異(p>0.05);尾靜脈一次最大注射40mg/kgTAP-SSL5,小鼠一般行為情況、血常規(guī)及主要臟器形態(tài)均正常,無(wú)死亡現(xiàn)象;SD大鼠,給予TAP-SSL5(1mg/kg,i.p)8周,

12、停藥恢復(fù)1周后,體重、血常規(guī)、臟器系數(shù)、血液生化及主要臟器形態(tài)與對(duì)照組比較均無(wú)明顯差異(p>0.05)。
　　結(jié)論：
　　融合蛋白TAP-SSL5可有效抑制C57BL/6J小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷后新生內(nèi)膜形成;其機(jī)制可能與TAP-SSL5抑制血液中單核-巨噬細(xì)胞向內(nèi)膜層的遷移和浸潤(rùn),以及減少TNF-α和MMP-9等炎癥因子的表達(dá)有關(guān);125I-TAP-SSL5在健康大耳兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程符合權(quán)重系數(shù)為1的二室模型,自體清除率