益氣活血中藥延緩增齡與高血壓所致血管老化的機(jī)制研究.pdf

1、人口老齡化是現(xiàn)代社會發(fā)展的重要問題之一,心血管疾病是老齡人口死亡的主要病因,年齡是心血管疾病的獨立危險因素。在增齡和心血管疾病中存在著明顯的血管老化的表現(xiàn),因此,對血管老化的研究成為老年病研究的熱點。血管老化病變特征為血管壁的增厚和硬化,可以表現(xiàn)在血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和胞外基質(zhì)水平。血管內(nèi)膜增厚,內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變,是血管老化在內(nèi)膜的表現(xiàn),本課題的前期研究已經(jīng)進(jìn)行了初步探討。平滑肌細(xì)胞是血管中膜的主要成分,其異常增殖、遷移

2、是血管老化的主要病理變化。本研究以血管老化為研究目的,在前期研究的基礎(chǔ)上,選取血管平滑肌細(xì)胞為切入點,從整體、細(xì)胞和分子水平對增齡和疾病所致血管老化進(jìn)行研究,通過探討益氣活血中藥延緩血管老化的作用和機(jī)制,為中醫(yī)藥延緩血管老化提供科學(xué)依據(jù)。
　　 本研究分為三個部分:文獻(xiàn)綜述、基礎(chǔ)研究和臨床研究。
　　 1.文獻(xiàn)綜述通過對衰老相關(guān)文獻(xiàn)的整理和歸納,總結(jié)了中西醫(yī)關(guān)于衰老的理論,并對中醫(yī)藥延緩衰老的機(jī)制進(jìn)行了闡述；通過對動脈僵

3、硬度相關(guān)文獻(xiàn)的復(fù)習(xí),綜述了常用檢測動脈僵硬度的檢測方法、臨床意義和研究進(jìn)展。
　　 2.基礎(chǔ)研究包括以下四個基礎(chǔ)實驗:
　　 實驗一:增齡與高血壓對大鼠主動脈結(jié)構(gòu)影響的實驗研究
　　 目的:觀察增齡與高血壓對動脈血管壁結(jié)構(gòu)的影響。方法:分別對老年大鼠和青年大鼠、自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和WKY大鼠的胸主動脈進(jìn)行HE染色和Masson染色。結(jié)果:HE染色顯示,老年大鼠和SHR大鼠的主動脈內(nèi)膜增厚,隆起,中膜顯著增

4、厚,平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移,細(xì)胞增大；Masson染色顯示,老年大鼠和SHR大鼠主動脈平滑肌、膠原相對含量顯著升高。結(jié)論:增齡和高血壓均可導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)的改變,呈現(xiàn)血管老化的特征,提示高血壓能誘發(fā)、促進(jìn)血管老化的發(fā)生。
　　 實驗二:大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定
　　 目的:探討大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法,為血管病變的研究提供重要的實驗材料。方法:采用組織貼塊法培養(yǎng)大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞,用倒置相差顯

5、微鏡觀察其生長狀況,用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果:鏡下可見培養(yǎng)細(xì)胞呈典型的“峰-谷”狀生長,免疫組化染色顯示胞漿內(nèi)α-actin陽性表達(dá)。結(jié)論:本法簡便、可靠,可獲純度較高、結(jié)構(gòu)和功能良好的血管平滑肌細(xì)胞,為研究心血管疾病提供了良好的實驗材料。
　　 實驗三:益氣活血中藥延緩老年大鼠血管老化的機(jī)制研究
　　 目的:觀察老年大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)衰老的病理變化,以及人參三七川芎提取物的干預(yù)作用和機(jī)制。方

6、法:采用原代培養(yǎng)的方法分別建立老年大鼠VSMC模型和青年大鼠VMSC模型,實驗分為青年組、老年組、普羅布考(Probucal)組、中藥低劑量組和中藥高劑量組。采用SA-β-gal染色法觀察細(xì)胞衰老改變,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期,免疫細(xì)胞化學(xué)法分析VSMC的MMP-9和TGFβ1含量,免疫熒光染色法檢測MLCK的表達(dá),RT-PCR和WesternBloting法檢測各組細(xì)胞p16、cyclinD1、CDK4、pRb和PPARγ的mRNA和蛋

7、白表達(dá)。結(jié)果:與青年大鼠相比,老年大鼠的VSMC增殖能力明顯增強(qiáng),人參三七川芎提取物能夠減少老年大鼠VSMC的SA-β-gal表達(dá),使細(xì)胞周期停滯于G1期,降低VSMC中MMP9、TGFβ1的表達(dá),升高M(jìn)LCK的表達(dá),并且增加p16、Rb、PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá),減少cyclinD1、CDK4的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)論:人參三七川芎提取物能夠延緩老年大鼠VSMC衰老,通過細(xì)胞因子和p16-CyclinD／CDK-RB途徑抑制VS

8、MC增殖、遷移,增強(qiáng)VSMC的收縮能力,減少增齡導(dǎo)致的血管結(jié)構(gòu)改變,提高血管彈性,延緩血管老化。
　　 實驗四:益氣活血中藥延緩SHR大鼠血管老化的機(jī)制研究
　　 目的:觀察SHR大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)衰老的病理變化,以及人參三七川芎提取物的干預(yù)作用和機(jī)制。方法:采用原代培養(yǎng)的方法分別建立WKY大鼠VSMC模型和SHR大鼠VMSC模型,實驗分為WKY組、SHR組、纈沙坦(Valsartan)組、中藥低劑量組和中藥

9、高劑量組。采用SA-β-gal染色法觀察細(xì)胞衰老改變,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期,免疫細(xì)胞化學(xué)法分析VSMC的MMP-9和TGFβ1含量,免疫熒光染色法檢測MLCK的表達(dá),RT-PCR和WesternBloting法檢測各組細(xì)胞p16、cyclinD1、CDK4、pRb和PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:與WKY大鼠相比,SHR大鼠的VSMC增殖能力明顯增強(qiáng),人參三七川芎提取物能夠減少SHR大鼠VSMC的SAβ-gal表

10、達(dá),使細(xì)胞周期停滯于G1期,降低VSMC中的MMP9、TGFβ1、MLCK表達(dá),并且增加p16、Rb、PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá),減少cyclinD1、CDK4的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)論:人參三七川芎提取物能夠延緩SHR大鼠VSMC衰老,通過細(xì)胞因子和p16-CyclinD／CDK-RB途徑抑制VSMC增殖、遷移,降低VSMC的張力,減少高血壓導(dǎo)致的血管結(jié)構(gòu)改變,延緩血管老化。
　　 3.臨床研究原發(fā)性高血壓中醫(yī)證侯特征及與

11、血管老化相關(guān)性的研究
　　 目的:研究原發(fā)性高血壓中醫(yī)證侯特征及與血管老化的相關(guān)性。方法:選擇111例原發(fā)性高血壓患者作為研究對象,24例健康入作為對照組,對高血壓患者的臨床癥狀進(jìn)行證素分類,分析其臨床證型分布,比較年齡、BMI、脈壓、PWV和MMP-9、AGEs與高血壓證型的相關(guān)性。結(jié)果:1.痰阻和陰虛是高血壓患者的主要證素特征,其后依次是陽亢、氣虛、血瘀、陽虛和血虛；2.高血壓主要的臨床證型為:陰虛陽亢證、痰濁壅盛證、痰瘀互